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1、定定量量 P PC CR R 引引物物探探针针设设计计原原则则 TTA standardization office【TTA 5AB-TTAK 08-TTA 2C】定定 量量P P C C R R引引 物物、探探 针针 设设 计计 原原 则则自 90 年代 Taqman 探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量 PCR 技术，Taqman 探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于 SYBR 荧光染料，Taqman 探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容
2、易；而相对于杂交探针，Taqman 探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量 PCR 要求。当然 Taqman 定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。一般 Taqman 定量 PCR 实验过程为：目的基因查找比对探针与引物设计探针与引物合成配置反应体系反应参数重复实验，优化条件获得曲线数据，比对标准曲线再重复验证。第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用 NCBI genbank 序列以及 DNAstar等软件完成目的 DNA 或者 RNA 的查找与比对这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个 cont
3、ig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻 DNA 片段重叠的情况）内。第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步引物探针的设计就可以说是定量PCR 成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。扩增长度应不超过 400bp，理想的最好能在 100-150bp 内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。保持 GC
4、含量在 20和 80之间，GC 富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是 G（不能有 4 个连续的 G）将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。引物设计原则序列选取应在基因的保守区段避免引物自身或与引物之间形成 4 个或 4 个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异
5、性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm 值在 5565（因为 60核酸外切酶活性最高），GC 含量在 40%60%引物之间的 TM 相差避免超过 2引物的 3端避免使用碱基 A，引物的 3端避免出现 3 个或 3 个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。Taqman 探针技术要求片段长度在 50bp150bp引物末端（最后 5 个核苷酸）不能有超过 2 个的 G 和 C。探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在 15-45bp（最好是 20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的 DNA 折叠和二级结构Tm 值在 65-70，通常比引物 TM 值高
6、 5-10（至少要 5），GC 含量在 40%70%探针的 5端应避免使用 G 鸟嘌呤因为 5G 会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。整条探针中，碱基 C 的含量要明显高于 G 的含量G 含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在 blast 中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。Taqman MGB 探针设计探针的 5端避免出现 G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的 G 碱基仍可淬灭基团的荧光信号。Tm 值应为 65-67。尽量缩短 Taqman MGB 探针，但探针长度不少于 13b
7、p。尽量避免出现重复的碱基，尤其是 G 碱基，应避免出现 4 个或 4 个以上的 G 重复出现。原则上 MGB 探针只要有一个碱基突变，MGB 探针就会检测到(MGB 探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行 SNP 检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB 不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间 1/3 的地方。注意：为了满足上述要求的 4 个条件，探针的突变位点可向 3端移动，但突变位点至少在离 3端 2 个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行 SNP 检测。反过来，若要进行同类检测，找的是
8、保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有 13 个 bp，探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的 5端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman 探针合成在 1000 到 5000 元不等（不同的合成要求价钱不同）而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。第四、五、六步：一般的定量 PCR 反应体系与普通 PCR 其实也差不了多少
9、，只是要加入 Taqman 探针，另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是：扩增酶最好选用热启动酶引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从 50nM 开始，在 50nM900nM 之间优化，一般为 200nM（注意探针需要避光保存。同样 Mg+和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是（50ul）DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下，因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的 DNA 模板添加量。如果欲进行 2Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应，第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总
10、体积的 10%。另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了，但是有时也需要进行优化。第七步：在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的 Ct 值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查 PCR 的效率，对于 100%PCR 效率来说，一个理想的斜率是。最佳的标准曲线是建立在 PCR 的扩增效率为 90%-100%(100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的 2 倍)的基础上。所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。大多数定量 PCR 仪都有这样一
11、个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。这其中有两种基本的方法：绝对定量和相对定量，研究人员需要根据自己的实验目的来选择。绝对定量是指将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的 DNA 样品，要注意得是绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的。相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率，没有确切的数字被检测道。另外由于不同的样品在反应过程中存在着一定的差异，因此除了要制作标准曲线来进行定量外，还需要设计表达水平相对较为稳定的内参基因来对结果进行标准化。-actin 和三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-pho
12、sphate dehydrogenase，GAPDH)是两种较常用的管家基因，另外还有 cyclophilin，18sr RNA，phosphoglyserokinase，beta-microglobulin，beta-glucronidase，hypoxanthineribosyl transferase，transferring receptor 等。要注意这些基因可以被反应条件所影响，在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必要的一步，而且严谨的研究人员会通过对一系列内参基因定量结果取几何平均数来对定量数据进行标准化。还有一个问题就是如何判断所得到数据的好坏，关于扩增曲线，经验总结
13、认为：1.总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。2.曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。扩增效率越高，试剂灵敏度表现会越好。3.基线，图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。4.曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。而扩增效率相近与否，反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。5.低浓度曲线指数期明显，一方面不易出现假阴阳性误判，另一方面说明灵敏度高。