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1、 小肠内分泌细胞系的处理方法与培养步骤【详细】一、细胞介绍 STC-1 细胞来源于双重转基因小鼠的肠肿瘤组织。含有连接大鼠胰岛素基因启动子与多瘤病毒小 T 抗原的融合基因与含有连接大鼠胰岛素基因与 SV40 的基因结合产生双转基因小鼠。这些小鼠一般患有肠肿瘤以及胰腺细胞瘤。STC-1 细胞产生激素分泌素。二、细胞特性 1、来源：肠道 2、形态：上皮细胞样，贴壁生长 3、含量：1x106 4、污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性 5、规格：T25 瓶或者 1mL 冻存管包装 三、细胞的运输和保存 可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式（1）干冰运输，收到后立即转入液氮或者-80 度冰箱冻存或直
2、接复苏；（2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。（3）收到细胞后请拍照，3 天内如果发现污染，请及时拍照与我们联系。四、细胞接收后的处理方法 1、收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。2、在显微镜下确认细胞生长状态时，最好在低倍镜（4 或 5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在 10X和 20物镜下，同时给刚收到的细胞拍照，（10，20）各 2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为细胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。3、观察好细胞状态后，75%酒精
3、消毒瓶壁将 T25 瓶置于 37培养箱放置约 2-3h。4、贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将 T25 瓶置于 37 培养箱放置约 2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞 1000rpm 离心 5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。5、悬浮细胞：T25 瓶置于 37 培养箱放置约 2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞 1000rpm 离心 5 分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。6、备注：运输用的培养基（灌液培养基）不
4、能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议 1：2 传代。五、细胞培养步骤 1、培养基及培养冻存条件准备：准备 DMEM 培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。2、培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为 70%-80%。3、冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。4、细胞处理：（1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37 水浴中迅速摇晃解冻，加入 4mL 培养基混合均匀。在 1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培
5、养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入 250px 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。（2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。（3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。2、加 2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37 培养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。3、按 6-8ml/瓶补加培
6、养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。4、将细胞悬液按 1：2 到 1：5 的比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。注：第一次传代推荐传代比例为 1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。下面 T25 瓶为类；1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。2、4min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于 1x1
7、06/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，至少 2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。六、注意事项 1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。2、收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置 2-4 小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100*，200*各一张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。3、由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于 7 天。4、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。