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1、1、重组质粒的鉴定 当质粒的重组或其他载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的本身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其他载体中含有相应的抗生素抗性基因，若重组成功，或不含质粒的自身环化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传代。若重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2、为扩增质粒和其他载体作准备 由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20-30min，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时间内极大的扩增目的质粒。一、实验一、
2、实验目的目的第1页/共15页二、实验原理二、实验原理 通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生51062107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。第2页/共15页三、实验流程：三、实验流程：灭活灭活物物/质粒质粒转化大肠杆菌转化大肠杆菌挑菌挑菌
3、摇菌摇菌菌液菌液PCRPCR第3页/共15页四、实验方法四、实验方法-冻融法冻融法连接产物灭活连接产物灭活7 700，10min10min（冰上解冻）大肠杆菌感受态细胞（冰上解冻）大肠杆菌感受态细胞5 50 0l l、灭火物灭火物1010l l混合物，冰上放置混合物，冰上放置3 30min0min42,42,9 90sec0sec冰上冰上2min2min加入加入10001000ulLBulLB液体（无抗）液体（无抗）3737，振荡，振荡1h1h离心离心10000rpm,1min,RT10000rpm,1min,RT去上清去上清800800l l留下留下200200涂板涂板3737恒温箱，倒置培
4、养恒温箱，倒置培养12h(12h(时间不得超过时间不得超过20h)20h)第4页/共15页1、无菌落，失败，或培养条件不充分。2、菌落布满如苔样，失败，可能是抗生素浓度不够或失效。3、菌落布满，抗生素浓度太高，失败。4、出现菌落，符合要求。（1）（2）（3）（4）第5页/共15页五、结果分析和失败原因五、结果分析和失败原因（1）有菌落，说明转化成功，但有两种可能性：其一，质粒自身环化；其二，重组成功。（2）无菌落，说明实验没成功。（3）菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够或失效。（4）出现大菌斑，大多数是霉菌污染所致。1 1、结果分析、结果分析第6页/共15页1、平板中的抗生素部分失效，长出的
5、克隆是杂菌。2、倒Ka平板时，培养基太烫，应冷却到50以下加Ka抗生素。2、涂板时来回用力过大，涂布环或者涂布棒灼烧过热，或不待冷却就涂布。3、感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响其转化，操作时动作迅速。4、操作时动作过于剧烈，减少对细胞的机械损伤。切记感受态细胞比较娇嫩。5、操作过程不规范，染菌。2 2、转化失败的原因、转化失败的原因第7页/共15页六、大肠杆菌感受态细胞的制备六、大肠杆菌感受态细胞的制备（1 1）从从LBLB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的 TOP10TOP10单菌落单菌落于于50ml LB50ml LB培养基中，培养基中，3737振振荡过夜；荡过夜；（2 2）将该
6、菌悬液以）将该菌悬液以1:100-1:501:100-1:50的比例接种于的比例接种于100ml LB100ml LB液体培养基中，液体培养基中，3737振荡培养振荡培养2-32-3小时至小时至OD600OD6000.50.5左右；左右；（3 3）将培养液转入离心管中，冰上放置）将培养液转入离心管中，冰上放置1010分钟，然后于分钟，然后于44下下4100rpm4100rpm离离心心1010min。（4 4）弃掉上清）弃掉上清,加入加入3 3预冷的预冷的CaClCaCl2 2 溶液，重悬，冰上放置溶液，重悬，冰上放置15-30min15-30min后，后，44下下41004100rpm离心离心
7、1010min；（5 5）弃掉上清，加入）弃掉上清，加入2ml2ml预冷的预冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaClCaCl，加入无菌甘油，加入无菌甘油300300l，重悬混匀重悬混匀,冰上放置几分钟；冰上放置几分钟；（6 6）分装，每管）分装，每管100l100l，液氮冷冻后，液氮冷冻后,保存于保存于-70-70冰箱。冰箱。第8页/共15页七、挑菌、摇菌七、挑菌、摇菌 （1）离心管标号（2）每个管内吸入650l l LB+Ka 抗生素（3）用牙签挑取单个菌（4）摇床上摇菌（时间大于8h）准备：离心管、牙签、镊子、LB+抗生素第9页/共15页八、八、蓝白斑筛选原理蓝白斑筛选原理 蓝白斑
8、筛选-筛选重组子：根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在许多载体都含有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。受体菌则含编码-半乳糖苷酶C端aa的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有-半乳糖苷酶表达，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）培养基中形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。第10页/共15页 蓝白斑筛选：（1）未转化的菌不具有抗性，不生长；（2）转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；（3）转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。第11页/共15页九、菌液九、菌液PCRPCR验证验证 加样：easy buffer:2.5l样数 DNTP：1.5l样数 M13R:1l样数 M13F:1l样数ll样数 混匀、离心 分装样品 跑电泳 跑PCR 混匀、离心 加菌液1l l（酒精灯前）（酒精灯前）第12页/共15页电泳图电泳图：第13页/共15页谢 谢！第14页/共15页感谢您的观看！第15页/共15页