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1、质粒简介质粒简介质粒质粒(plasmid)(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNADNA分子分子 其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复复 制和遗传的辅助性遗传单位。制和遗传的辅助性遗传单位。第1页/共55页ChromosomeDNAgenomePlasmidDNA第2页/共55页 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工
2、质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术最基本的实验技术 第3页/共55页质粒特性质粒特性1.1.分子相对小分子相对小 2.2.含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分 3.3.不相容性不相容性(incompatibility)(incompatibility)4.4.转移性转移性5.5.选择的标记选择的标记(selective markers)(selective markers)6.6.限制性内切酶单一切口限制性内
3、切酶单一切口第4页/共55页质粒的结构特点分子量相对较小 共价闭合分子 双链环状结构具有更强的抗切割和抗变性能力超螺旋DNA分子 线性DNA分子 半开环DNA分子第5页/共55页Plasmidvectors第6页/共55页表达载体载体含有tac启动子、Lac操纵基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等Exprssion vector第7页/共55页细菌收集纯化质粒DNA细菌培养细菌裂解质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 第8页/共55页质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 一、细菌的培养一、细菌的培养 (bacterial culture)(bacterial culture
4、)l l 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒生长，质粒DNADNA也在自主复制。也在自主复制。第9页/共55页 对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素（菌对数生长后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白质的合成和染色抑制宿主蛋白质的合成和染色体体DNADNA的复制。质粒的复制。质粒DNADNA的复制不受影响而大量扩增的复制不受影响而大量扩增第10页/共
5、55页l所所以以使使用用氯氯霉霉素素的的主主要要目目的的，是是在在不不减减低低质质粒粒产产量量的的前前提提下下，减减少少细细菌菌的培养体积和细菌的数量的培养体积和细菌的数量 有有时时质质粒粒在在细细菌菌中中的的扩扩增增状状况况很很差差，常常是是由由于于质质粒粒携携带带外外源源基基因因或或质质粒粒分分子量过大所致。子量过大所致。第11页/共55页二、细菌的收集二、细菌的收集(bacterial(bacterial collection)collection)细细胞胞生生长长过过程程中中，排排出出大大量量代代谢谢产产物物，为为了了提提高高质质粒粒DNADNA的的纯纯度度，离离心心弃弃上上清清，细细
6、菌菌沉沉淀淀最最好好用用STESTE或或生生理理盐盐水水悬悬浮浮，漂漂洗洗l-2l-2次次，离离心心管管壁壁上上的的液液体体也也应应该该仔仔细去除干净。细去除干净。第12页/共55页三、细菌裂解细细胞胞的的裂裂解解方方法法很很多多，如如去去污污剂剂法法，沸沸水水热热裂裂法法、碱碱变变性性法法，有有机机溶溶剂剂法法和和溶溶菌菌酶酶法法等等。不不同同方方法法各各有有利利弊弊，一一般般要要根根据据质质粒粒性性质质、宿宿主主菌菌的的特特性性及及后后继继的的纯纯化化方方法法等等多多种种因因素素综合后加以选择综合后加以选择。第13页/共55页质粒提取的方法碱裂解法(Alkaline)煮沸裂解法SDS裂解法
7、其他第14页/共55页质粒质粒DNADNA提取方法的选择提取方法的选择 l常常用用的的煮煮沸沸法法，碱碱法法,SDSSDS法法均均可可获获得得较较满满意意效效果果至至于于有有人人采采用用碱碱法法提提取取小小量量细细菌菌培培养养物物的的质质粒粒，用用煮煮沸沸法法或或SDSSDS法法进进行行质质粒粒DNADNA的的大大量量分分离离，只只是各个实验室的习惯问题是各个实验室的习惯问题.第15页/共55页l选择哪种方法制备质粒选择哪种方法制备质粒DNADNA，应考虑以下因素：应考虑以下因素：1 1菌株类型（菌株类型（typetype）2 2质粒的大小质粒的大小(size)size)3 3细菌染色体细菌染
8、色体DNADNA变性条件强弱的控制变性条件强弱的控制 (denaturation condition)denaturation condition)质粒DNA的小量制备2-5ml质粒DNA的大量制备500ml第16页/共55页大质粒（15kb）的处理方法：采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid损伤减少小质粒（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。第33页/共55页（四）其它方（四）其它方法法2、牙签少量制备法1、小量一步提取法第34页/共55页1、小量一步提取法 直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大
9、部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA。本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。第35页/共55页（二）牙签少量制备法 用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA。由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。第36页/共55页质粒质粒DNADNA的纯化的纯化.CsCl-EB法.聚乙二醇沉淀法.柱层析法第37页/共55页EBCsCl密度梯度离心法EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。
10、第38页/共55页 超速离心将介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中间，由于不同结构的DNA与EB结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的DNA区分开。第39页/共55页EBCsCl密度梯度离心法示意图第40页/共55页第41页/共55页l转基因动物，真核细胞转染及转基因动物，真核细胞转染及DNADNA外切酶酶外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链切缺失等实验，对闭合环状双链DNADNA的要求较的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。高，一般还是用超速离心法纯化质粒。对于对于DNADNA片段酶切回收，
11、内切酶图谱分析、片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的直接用小量或中量提取的DNADNA样品，并不需要样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。超速离心纯化，一般可满足实验要求。第42页/共55页2 2 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法 分级沉淀，首先利用分级沉淀，首先利用LiClLiCl沉淀大分子沉淀大分子RNARNA，用用RnaseRnase酶消化小分子酶消化小分子RNARNA；在在利用乙二醇选择性沉淀大质粒利用乙二醇选择性沉淀大质粒DNADNA，再利用酚再利用酚-氯仿抽提。氯仿抽提。方法简单实
12、用，但是不能区分环状或开链质粒方法简单实用，但是不能区分环状或开链质粒DNADNA第43页/共55页3 3 柱层析法柱层析法以硅基质作为填充层析柱的树脂，在多盐的条件下，以硅基质作为填充层析柱的树脂，在多盐的条件下，DNADNA与硅基质可逆性的与硅基质可逆性的结合进行纯化。结合进行纯化。多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用50%50%的乙醇洗去的乙醇洗去RNARNA和糖类物质，再加入和糖类物质，再加入TETE或水，离心洗脱。或水，离心洗脱。第44页/共55页第45页/共55页实验步骤取菌液1ml置离
13、心管中，1000012000r/min,离心1min，去掉上清液。加入预冷的100ul溶液I，充分混匀，室温放置2min。加入200ul溶液II,颠倒混匀510次，冰上放置2min。加入150ul溶液III，颠倒混匀510次，冰上放置10min。1000012000r/min离心5min,取上清至新的离心管中。第46页/共55页上清液中加入等体积苯酚/氯仿，振荡混匀，1000012000r/min离心2min，将上清转移至新离心管中。加入5mol/LNaCl150ul，后加入2倍体积无水乙醇，混匀后1000012000r/min5min。去除上清液，加入0.5ml70%乙醇，8000r/min
14、离心5min，清洗沉淀，干燥。加入20ulTE，溶解沉淀，1：100稀释后测定浓度。第47页/共55页PCR-PCR-单链构型多态性分析单链构型多态性分析Single Strand Conformation Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP Polymorphism,SSCP 第48页/共55页PCR-SSCP单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成。突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DN
15、A不同顺序不同构象不同电泳行为第49页/共55页什么是PCR-SSCP？PCR-SSCP是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法。将单链的扩增DNA或组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱基的改变。第50页/共55页第51页/共55页第52页/共55页银染原理 根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基，一定条件下可以与银离子结合，在甲醛等还原剂的作用下，形成黑或褐色的银沉淀条带。第53页/共55页影响PCR-SSCP的因素1.DNA片段大小2.复制错误发生3.电泳条件:（1）丙烯酰胺的浓度（2）交联剂的浓度（3）电泳的物理环境（4）甘油浓度第54页/共55页感谢您的观看！第55页/共55页