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1、一、含义二、优越性三、应用四、定量方法五、荧光材料六、结果分析第1页/共20页一、含义实时荧光定量PCR技术(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。第2页/共20页二、优越性特异性荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。敏感性荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml，对数期分析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量较为准确，标本不需稀释。重复
2、性荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。自动化无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。第3页/共20页三、应用用于核酸的定量如RNA、DNA的定量用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA变异分析，溶解曲线分析等。第4页/共20页四、定量方法1.标准曲线法的绝对定量2.标准曲线法的相对定量3.比较CT法的相对定量第5页/共20页五、荧光材料荧光探针和荧光染料SYBRgreenI水解探针TaqMan分子信标杂交探针第6页/共20页SYB
3、R green I未结合的SYBR green I第7页/共20页水解探针TaqMan荧光素淬灭剂 与目标序列互补FAMTETJOEHEXVIC TAMRA DABCYL 第8页/共20页探针与目标序列配对时，发生荧光共振能量转移(FRET)光光能量转移Taq游离的探针荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq发出荧光光另一波长的荧光第9页/共20页分子信标荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补 淬灭剂淬灭剂 茎茎(5-7bp)环（15-30bp）FAM Texas Red 第10页/共20页探针杂交到DNA模板光发出荧
4、光DNA 模板淬灭剂淬灭剂 茎茎 环光淬灭第11页/共20页杂交探针555发出荧光5555第12页/共20页六、结果分析基线（Baseline）指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光域值threshold的设定一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。第13页/共20页CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。第14页/共20页基线期指数期线性期平台期荧光阈值线CT值第15页/共20页融解曲线分析融解温度TM第16页/共20页第17页/共20页非特异扩增产物目的基因产物第18页/共20页比较CT法的相对定量表达差异计算假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出目的基因的量=2-Ct Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照 2-Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数第19页/共20页感谢您的观看！第20页/共20页