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1、第1页/共37页Bimolecular Fluorescence Complementation(BIFC)：双分子荧光互补CFP:青色荧光蛋白AUX1:integral plasma membrane protein第2页/共37页第3页/共37页P T IE T I第4页/共37页第5页/共37页第6页/共37页第7页/共37页病原相关分子模式PRRs:模式识别受体PRPs:病原相关蛋白14-3-3:蛋白家族，主要通过与磷酸化丝氨酸模体结合发挥作用第8页/共37页RPM1-INTERACTING PROTEIN4-RIN4 Plant Cell 第9页/共37页circular dichr
2、oism(CD)spectrosccopyProtein Disorder Prediction System(PrDOS)第10页/共37页第11页/共37页H+-pumping activity was detected by a decrease of acridine orange absorbance at 495nm第12页/共37页AHA1-NLUCRIN4-CLUCsplit luciferase complementation assay:分裂荧光素酶互补分析法RLU：相对光单位第13页/共37页cor-mutant reduce virulence upon surface
3、 inocultion第14页/共37页RIN4ADP第15页/共37页pRIN4 suppress the ROS burstT21,T166 conservedbut S160 is notwhich is unable to deliver effectors and elicits strong PTIthe ROS burst analyzed with a luminometersyringe infiltrated第16页/共37页30uM3uMP.fluorescens EtHAn system enabling single effector delivery.第17页/共3
4、7页总结（1)1)若病菌为PstDC3000PstDC3000，则宿主感知其flg22flg22，抑制RIN4RIN4磷酸化，使AHAAHA活性下降，气孔关闭，避免菌进一步进入宿主细胞，使用PTIPTI途径灭菌。（2)2)若病菌为PstDC3000PstDC3000（AvrBAvrB）等，可刺激宿主游离的PIPKPIPK与RIN4RIN4结合并使之磷酸化，破坏PTIPTI介导（感知flg22flg22）的气孔关闭，依赖RIN4-AHARIN4-AHA通路扩大气孔，使更多的菌进入宿主细胞，若宿主R R基因（如RPM1RPM1）突变，则使之感病。（3 3）若病菌为PstDC3000PstDC300
5、0（AvrBAvrB）等，虽可诱导RIN4RIN4磷酸化，但同时宿主R R基因也能识别磷酸化的RIN4RIN4，随即触发ETIETI途径，发生HRHR反应，避免菌进一步扩散。第18页/共37页T-DNAT-DNA简介T-DNA（转移DNA）是农杆菌Ti质粒中的一段DNA，大小约为23kb，当农杆菌侵染植物时，该区段能自发随机、稳定的整合到植物基因组中，大多为单插入，符合孟德尔分离定律。第19页/共37页第20页/共37页复制起始点右边界左边界Vir区：可激活T-DNA，使Agr表现出毒性，故称为毒区。冠瘿碱代谢生长素冠瘿碱细胞分裂素第21页/共37页T-DNAT-DNA加工及转移第22页/共3
6、7页第23页/共37页第24页/共37页PCRPCR三引物法测定T-DNAT-DNA突变体第25页/共37页第26页/共37页第27页/共37页拟南芥基因组DNADNA提取（1 1）准备2 2套1.5mlEP1.5mlEP管第一套加200ul200ul提取缓冲液，第二套加200ul200ul异丙醇。（2 2）取拟南芥叶片少许加到第一套EPEP管中研磨。（3 3）12000rpm12000rpm离心5min5min。（4 4）取200ul200ul上清液于第二套EPEP管中，与异丙醇充分混匀。（5 5）将EPEP管置于-24-2430min30min以上（组织多则时间越久）。（6 6）12000
7、rpm12000rpm离心5min5min。（7 7）弃上清，每个EPEP管加75%75%乙醇500ul500ul，充分混匀，使沉淀溶解。（8 8）12000rpm12000rpm离心5min5min。（9 9）弃上清，9696蒸干乙醇。（1010）40ul40ulTETE（1x1x）溶解，可置于3737恒温箱助溶，1h1h后即可进行PCRPCR。提取缓冲液成分：Tris-HclTris-Hcl、NaclNacl、EDTAEDTA、SDSSDS第28页/共37页第29页/共37页第30页/共37页接下来的实验设计第31页/共37页有性杂交鉴定单插入（1）选择母本（刚能看到白色花瓣的花）。（2）
8、去雄（呈微黄色）。（3）选择父本（选择花完全盛开，呈十字状，雄蕊很黄的花）。（4）人工授粉（用镊子夹住雄蕊柄部取下，在母本柱头上擦拭数次，套袋并标记）。（5）观察记录（柱头在发育长大，表明授粉成功）。（6）得到F1代。播种鉴定，若符合3:1则为单插入，可以继续实验。第32页/共37页野生型、互补型、缺失型、过表达型抗病性比较互补型：利用“一步克隆法”构建含R基因的质粒载体，导入单插入缺失突变体中，采用诱导性启动子，得到基因互补型。过表达型：采用利用“一步克隆法”构建含R基因的质粒载体，导入野生型中，采用诱导性启动子，得到基因过表达型。第33页/共37页分别向野生型拟南芥喷洒致病菌，验证R基因功能。理论上，抗病性宏观结果（HR）应为：缺失体互补型野生型互补型野生型过表达型第34页/共37页寻找与R基因互作的物质A（1）体外实验：酵母双杂交实验。（2）体内试验：例如1）双分子荧光互补实验。2）抗体检测（磷酸化抗体、乙酰化抗体等）。第35页/共37页缺失突变与过表达物质A理论结果：1）缺失突变：拟南芥抗病性能减弱。2）过表达突变：拟南芥抗病性能增强。即抗病结果为：缺失型WT过表达型第36页/共37页感谢您的观看！第37页/共37页