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1、1、在空气过滤除菌的过程中空气储罐的作用是 ，丝网除沫器的作用是 。空气加热设备的作用是 。2、空气过滤器按过滤介质空隙大小分为 和 。3、介质孔隙大于被拦截的微生物大小，但介质层有一定的厚度，机理是静电、扩散、惯性及拦截作用。4、在实验室或中试规模，空气过滤器只设 级，而大型发酵工厂大多采用 级过滤。5、工厂发酵生产中棉花活性炭过滤器一般用作 ，金属烧结管和微孔膜过滤器一般用作 。缓冲空气脉冲除去 较小液滴降低空气的湿度绝对过滤深层过滤一二总过滤器分过滤器第1页/共92页1、连续提供一定流量的压缩空气。VVM一般为0.12.0 m3。2、空气的压强(表压)为0.20.4 MPa。3、进入过滤
2、器之前，空气的相对湿度70。4、进入发酵罐的空气温度可比培养温度高1030。5、压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败概率为10-3为指标。发酵用无菌空气的基本要求第2页/共92页1、湿热灭菌的条件是 。2、发酵培养基灭菌中，方法对灭菌的蒸汽压力要求高。在分批灭菌过程中要先 通过 进行预热，在通入蒸汽升温到121。3、连消的特点是、连消的特点是 和和 ，适合，适合 发发酵罐。酵罐。夹套或蛇管121 30min 连续灭菌快速高温大型第3页/共92页对数穿透定律：对数残留定律对数生长定律比热死速率过滤常数比生长速率第4页/共92页发酵工程的流程空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子
3、罐发酵罐培养基制备灭菌灭菌产物分离纯化成品成品原料预处理原料预处理第5页/共92页种 子 扩 大 培 养 现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。第6页/共92页一、概述 1、定义：菌种的扩大培养就是把保藏在砂土管、冷冻干燥管中处于休菌种的扩大培养就是把保藏在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或摇摇瓶和种子罐，逐级扩大培养瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种
4、培养过程。这些纯种的培养物称为后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。第7页/共92页 2、作为生产用种子的准则1 1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。后能迅速生长，延滞期短。2 2）生理性状稳定）生理性状稳定3 3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求要求4 4）无杂菌污染）无杂菌污染5 5）保持稳定的生产能力）保持稳定的生产能力第8页/共92页第9页/共92页实验室种子制备阶段实验室种子制备阶段（一级种子培养）（一级种子培养）生产车间种子制备阶段生产车间种子制备阶段（
5、二级种子培养、（二级种子培养、三级种子培养）三级种子培养）二级发酵二级发酵 三级发酵三级发酵砂土孢子砂土孢子冷冻干燥孢子冷冻干燥孢子斜面孢子斜面孢子摇瓶液体培养摇瓶液体培养茄子瓶斜面培养茄子瓶斜面培养固体培养基培养固体培养基培养一级种子罐一级种子罐二级种子罐二级种子罐发酵罐发酵罐二、种子制备工艺二、种子制备工艺第10页/共92页第11页/共92页 生产菌种的制备 两个过程：在固体培养基上生产大量孢子的两个过程：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在过程和在液体培养基上生产大量菌丝的液体培养基上生产大量菌丝的种子制备过程过程孢子的产生条件？第12页/共92页孢子制备1.放线菌孢子的制备放线
6、菌孢子的制备 工艺过程工艺过程菌菌种种母母斜斜面面摇摇瓶瓶种种子子种种子子罐罐发发酵酵罐罐子子斜斜面面第13页/共92页 注意事项限制碳源限制碳源(约约1%)和氮源和氮源(不超过不超过0.5%)；培养温度多为培养温度多为28 ，少数为，少数为37 ，培养时间为，培养时间为514天；天；采用孢子进罐：工艺简单，批间差异小，便于控制孢子质量；采用菌丝进罐：采用孢子进罐：工艺简单，批间差异小，便于控制孢子质量；采用菌丝进罐：可缩短种子罐内的培养时间可缩短种子罐内的培养时间(尤适生长缓慢的菌种尤适生长缓慢的菌种)。第14页/共92页2.霉菌孢子的制备霉菌孢子的制备 注意注意事项事项天然农产品因具有独特
7、的营养成分天然农产品因具有独特的营养成分 和较大表面积而适合作霉和较大表面积而适合作霉菌的培养基菌的培养基 培养温度多为培养温度多为2528 ，培养时间为，培养时间为414天天第15页/共92页3.细菌孢子的制备细菌孢子的制备 注意事项注意事项1.适合采用碳源限量而氮源丰富的培养基适合采用碳源限量而氮源丰富的培养基2.培养温度多为培养温度多为37 ，少数为，少数为28 ，培养时，培养时 间细菌菌体为间细菌菌体为12天，产芽孢天，产芽孢的细菌为的细菌为510天天第16页/共92页种子制备概念：指将固体培养基上培养出的概念：指将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到转入到液体培养基种培养，使其繁殖成
8、大量液体培养基种培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。的过程。摇瓶种子摇瓶种子 种子罐种子种子罐种子第17页/共92页1.摇瓶种子制备摇瓶种子制备 孢子发芽或菌丝孢子发芽或菌丝繁殖缓慢的菌种需将孢子经摇瓶培养成菌丝的菌种需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，后再进入种子罐，摇瓶具有浓缩种子罐的作用，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。种子培养基营养应丰富完全，易被菌体利用，浓度不宜过高。种子培养基营养应丰富完全，易被菌体利用，浓度不宜过高。第18页/共92页2.种子罐种子制备种子罐种子制备A.孢子或摇瓶菌丝被接入体积较小的种子罐中，培孢子或摇瓶菌丝被接入
9、体积较小的种子罐中，培养后形成的大量菌丝，这种种子称为一级种子养后形成的大量菌丝，这种种子称为一级种子B.把一级种子转入发酵罐中发酵，称为二极发酵把一级种子转入发酵罐中发酵，称为二极发酵C.种子罐的级数主要决定于菌种的性质、菌体的生种子罐的级数主要决定于菌种的性质、菌体的生长速度和发酵设备的合理应用长速度和发酵设备的合理应用D.种子罐级数减少，有利于生产过程的简化和发酵种子罐级数减少，有利于生产过程的简化和发酵过程的控制，减少因种子生长异常而造成的发酵过程的控制，减少因种子生长异常而造成的发酵波动波动第19页/共92页实验室种子制备阶段：琼脂斜面琼脂斜面 固体培养基扩大培养固体培养基扩大培养
10、摇瓶液体培养摇瓶液体培养生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养种子罐扩大培养第20页/共92页对接种物的一般要求：1 1）应以高产菌株中分离获得的纯系作为出发）应以高产菌株中分离获得的纯系作为出发菌株。菌株纯度高，性状稳定，不易发生变异。菌株。菌株纯度高，性状稳定，不易发生变异。2 2）生理活性强。）生理活性强。若以菌体细胞为接种物，应采取正在旺盛生若以菌体细胞为接种物，应采取正在旺盛生长的繁殖期细胞，菌体细胞应均匀，同步率高。长的繁殖期细胞，菌体细胞应均匀，同步率高。以孢子为接种物，应采用易于萌发的孢子。以孢子为接种物，应采用易于萌发的孢子。第21页/共92页为了提高孢子的萌发率，有时需采取一
11、些特殊措施 如：丙酮丁醇梭菌的孢子在沸水中处理丙酮丁醇梭菌的孢子在沸水中处理9090秒后在秒后在放入液体培养基底部，可获得较高的发芽率。放入液体培养基底部，可获得较高的发芽率。有的孢子不被水浸润，浮在液体培养基表有的孢子不被水浸润，浮在液体培养基表面或贴在培养容器内壁，不形成悬液。可在培面或贴在培养容器内壁，不形成悬液。可在培养基中加入少量无毒的表面活性剂，帮助形成养基中加入少量无毒的表面活性剂，帮助形成悬液。悬液。第22页/共92页1、实验室种子制备 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用殖快的菌种可以采用固体培养基固体培养基培养孢子，培养
12、孢子，孢子可直接作为种子罐的种子；这样操作简孢子可直接作为种子罐的种子；这样操作简便，不易污染杂菌。便，不易污染杂菌。如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产生大量孢子直接用于种子罐接种。生大量孢子直接用于种子罐接种。第23页/共92页 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用可以用摇瓶液体培养摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中，恒温振荡培养，获得菌丝体，养基的摇瓶中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。作为种子。如：用灰色链霉菌生产链霉素如：用灰色链霉菌生产链霉素 用卡那链霉菌生产卡那霉素
13、用卡那链霉菌生产卡那霉素第24页/共92页 对于不产孢子的细菌，生产上一般采对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培用将试管斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养。养。如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸第25页/共92页 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等。如同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等。如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝
14、）体在培养液果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。中均匀分布，获得相同的培养条件。2、生产车间种子制备、生产车间种子制备第26页/共92页2）种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。到一定的菌体量，以利于产物的合成。种子罐种子罐第27页/共92页2）种子罐级数的确定种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培是指制备种子需逐级扩大培养的次数。养的次数。一般根据菌种一般根据菌种生长特性生长特性、孢子发芽孢子
15、发芽及及菌菌体繁殖速度体繁殖速度以及所采用以及所采用发酵罐的容积发酵罐的容积而而定。定。第28页/共92页细菌：细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶茄子瓶种子罐种子罐发酵罐发酵罐 霉菌：霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢孢子子悬悬浮浮液液一一级级种种子子罐罐（27C,40小小时时孢孢子子发发芽芽，产产生生菌菌丝丝）二二级级种种子罐（子罐（27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐发酵罐 放线菌：放线菌：生长更慢，采用四级发酵生长更慢，采用四级发酵酵母：
16、酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 第29页/共92页种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会；染菌机会；确定种子罐级数需注意的问题确定种子罐级数需注意的问题第30页/共92页第31页/共92页第32页/共92页u对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应也少。子罐相应也少。如：如：谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面
17、或摇瓶种谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于子接入种子罐于32培养培养710h，菌体浓度达，菌体浓度达108109个个/ml，即可接入发酵罐作为种子。，即可接入发酵罐作为种子。这称为这称为一级种子罐扩大培养，也称，也称二级发酵。第33页/共92页u 生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于2727培养培养40h40h，此时孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有，此时孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于新鲜培养基的第二级种子罐，于2727培养培养101024h24h，
18、菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子。酵罐作为种子。这称为这称为二级种子罐扩大培养，也称，也称三级发酵。一般一般50m3发酵罐都采用三级发酵发酵罐都采用三级发酵第34页/共92页 生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养（四级发酵）在小型罐（在小型罐（5 5500L500L）中进行实验时，通常）中进行实验时，通常采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，这可采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，这可称为称为一级发酵。第35页/共92页种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控种子
19、罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来的染菌的机制，并可减少由于多次移种而带来的染菌的机会。会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。时间，以提高发酵罐的生产率。第36页/共92页 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关。而定，但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的
20、级芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。数。第37页/共92页种子罐1 发酵罐1 发酵罐2 种子罐2 移种方式：1）单种 2）双种 3）倒种 4）混种第38页/共92页1）单种：一个种子罐接种到一个发酵罐中。2）双种：为加大接种量，两个种子罐接种到一个发酵罐中。3）倒种：种子罐染菌又无备用种子时或种子质量不理想可采样倒种法，以适宜的发酵罐倒出部分给另一发酵罐。4）混种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。第39页/共92页2）种龄种龄种龄种子罐中培养的菌体开始移入下种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。一级种子罐或发酵罐时的培养时间。选择适当种龄的菌种接种十
21、分重要选择适当种龄的菌种接种十分重要通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。为合适。第40页/共92页 过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、发酵周期延长、产物开始形现前期生长缓慢、发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，造成异常发酵的情况。成的时间推迟，造成异常发酵的情况。过老的种子会引起生产能力下降，菌体过过老的种子会引起生产能力下降，菌体过早自溶。早自溶。第41页/共92页 不同品种或同一不同品种或同一品种的工艺条
22、件不品种的工艺条件不同，其菌龄也不一同，其菌龄也不一样，一般要经过多样，一般要经过多次试验，考察其发次试验，考察其发酵罐中产量的多少酵罐中产量的多少来确定最适种龄。来确定最适种龄。嗜碱性芽孢杆菌种龄对产酶嗜碱性芽孢杆菌种龄对产酶（碱性蛋白酶）的影响（碱性蛋白酶）的影响第42页/共92页3）接种量接种量接种量是指移入的种子液体积和接种后是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。培养液体积的比例。大多数抗生素发酵的最适接种量为大多数抗生素发酵的最适接种量为7 715%15%，有，有时可增加到时可增加到20 20 25%25%；而由棒状杆菌生产谷氨；而由棒状杆菌生产谷氨酸酸 接种量只需接种量只需
23、1%1%。除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的各阶段接种量一般均需各阶段接种量一般均需0.50.510%10%的接种量。的接种量。接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖的速度。繁殖的速度。第43页/共92页 采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前体繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来。到来。近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施；有的产品采用富培养基作为获得高产的措施；有的产品采
24、用两个种子罐接一个发酵罐的双种法。两个种子罐接一个发酵罐的双种法。如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高单位提高8%8%，且达到产量高峰的时间提前。，且达到产量高峰的时间提前。第44页/共92页 但如果接种量过大，往往使菌体生长过快、但如果接种量过大，往往使菌体生长过快、培养液黏度增加，造成溶氧不足，从而影响产培养液黏度增加，造成溶氧不足，从而影响产物的合成。物的合成。如由嗜碱芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的发酵，如由嗜碱芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的发酵，1%1%接种量产酶活最高，在接种量产酶活最高，在0.50.54%4%之间虽有差之间虽有差别，但影响不大；如超过
25、别，但影响不大；如超过4%4%则酶产量明显下则酶产量明显下降。降。第45页/共92页3、种子质量的判断 为了保证各级种子移种前的质量，除为了保证各级种子移种前的质量，除了保证规定的培养条件外，在过程中还要了保证规定的培养条件外，在过程中还要定期取样测定一些参数以观察基质的代谢定期取样测定一些参数以观察基质的代谢变化及菌体形态是否正常。变化及菌体形态是否正常。第46页/共92页1、细胞或菌体、细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观单细胞：单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形整齐，有的还要求有一定的排列或形态；态；
26、霉菌、放线菌：霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。况和内含物情况好。第47页/共92页2、生化指标、生化指标 通常测定的参数有：1 1）pH pH 2 2）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量变化）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量变化3 3）菌体形态、菌体浓度和培养液外观（色素、）菌体形态、菌体浓度和培养液外观（色素、颗粒等）颗粒等）4 4）其它参数，如某种酶的活力）其它参数，如某种酶的活力 如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系，可通过测定种子液中
27、淀酵单位有一定关系，可通过测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量。粉酶的活力判断种子质量。第48页/共92页细菌菌体浓度的测量方法有细菌菌体浓度的测量方法有 。霉菌浓度的测量方法有霉菌浓度的测量方法有 。霉菌或放线菌孢子测量的方法有霉菌或放线菌孢子测量的方法有 。OD600测干重血球板计数稀释平板计数测干重离心测体积血球板计数稀释平板计数第49页/共92页细菌培养温度多为 ，发酵。霉菌培养温度多为 ，发酵，放线菌培养温度多为 。发酵。酵母 发酵A.25-28 B.28 C.37A.二级 B.三级 C.四级二级发酵二级二级二级二级3725-28 28第50页/共92页3、产物生成量、产物生成量 在
28、抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。第51页/共92页4、酶活力、酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。第52页/共92页种子异常分析种子异常分析 菌种生长速度，过快或过慢菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团菌丝结团菌丝粘壁菌丝粘壁 第53页/共92页影响孢子质量影响孢子质量的因素的因素及控制及控制培养基培养基培养条件培养条件培养时间培
29、养时间和和冷藏时间冷藏时间三、影响种子质量的因素第54页/共92页1、培养基生产过程中经常出现种子质量不稳定的现生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是象，其主要原因是原材料质量波动。原材料质量的波动，起主要作用的是其中的无机离子含量不同。如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。第55页/共92页1、培养基生产过程中经常出现种子质量不稳定的现生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是象，其主要原因是原材料质量波动。如：如：四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的麸皮，因小麦产地
30、、品种、加工方法及用量的用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量均有一定影响。不同对孢子质量均有一定影响。制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。度不同，孢子质量也不同。蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响也不同。响也不同。水质的硬度、污染程度对生产均有影响水质的硬度、污染程度对生产均有影响第56页/共92页水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培养基上
31、可呈现多种不同代谢类型的菌落，菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。第57页/共92页措施培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用严格控制灭菌后培养基的质量严格控制灭菌后培养基的质量斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源则采用较复杂的有机氮源第
32、58页/共92页2、培养条件1）温度2）湿度 不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的影响相对湿度相对湿度 斜面外观斜面外观 活孢子数活孢子数（108/支）支）16.516.519 19 上部稀薄，下部稠，略黄上部稀薄，下部稠，略黄 1.21.2252536 36 上部薄，中部均匀，发白上部薄，中部均匀，发白 2.32.3404045 45 一片白，孢子丰富，稍皱一片白，孢子丰富，稍皱 5.75.73）通气量一般需保证充足的通气一般需保证充足的通气温度对多数品种斜面孢子温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。质量有显著影响。如如 ：土霉素生产种子，在高于：土霉素生产种子，在高于3737培养时，
33、孢子接入发酵罐后表现出培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等。丝过早自溶，效价降低等。制备斜面孢子培养基的湿度对孢子制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大影响。的数量和质量有较大影响。第59页/共92页第60页/共92页3、培养时间和冷藏时间（1）培养时间）培养时间一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的
34、下降。措施：孢子培养的时间应该控制在措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终的阶段终止培养。止培养。第61页/共92页（2）斜面冷藏时间）斜面冷藏时间斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即天左右即于于4C冰箱保存，发现冷藏冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞天菌体细胞开始自溶。而培养开始自溶。而培养5天以后冷藏，天以后冷藏，20天未发天未发现自溶。现自溶。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。
35、如在链霉素生产中，斜面孢子在如在链霉素生产中，斜面孢子在6冷藏冷藏2个月后的发酵单位比冷藏个月后的发酵单位比冷藏1个月降低个月降低18%，冷藏冷藏3个月后降低个月后降低35%。第62页/共92页4、接种量接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。第63页/共92页影响种子质量影响种子质量的因素及控制的因素及控制接种量接种量种龄种龄孢子的质量孢子的质量培养基培养基培养条件培养条件四、种子质量的控制措施四、种子质量的控制措施第64页/共92页1、培养基、培养基营养成分适合种子培养的需要；营养成分适合种子培养的需要；选择有
36、利于孢子发芽和菌体生长的培养基；选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高。营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高。营养成分要尽可能与发酵培养基相近。营养成分要尽可能与发酵培养基相近。第65页/共92页2、培养条件、培养条件（1）温度温度（2）通气量通气量:在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气例如，青霉素的生产菌
37、种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。的通气量小对发酵有利。第66页/共92页3、种龄、种龄种龄：种龄：是指种子罐中培养的菌丝是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺通常种龄是以处于生命力极旺盛的盛的对数生长期，对数生长期，菌体量还未菌体量还未达到最大值时的培养时间较为达到
38、最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。缓慢。第67页/共92页不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。小时最好。第68页/共92页4、接种量、接种量接种量：接种量：是指移入的种子液体是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的积和接种后培养液体积的比例。比例。接种量的大小
39、决定于生产接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。可减少杂菌的生长机会。第69页/共92页但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率
40、。通常接种量，细菌通常接种量，细菌15%，酵母菌，酵母菌510%，霉菌，霉菌715%、有时、有时2025%。第70页/共92页种子质量的控制措施种子质量的控制措施种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力生产能力。首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。菌侵入，以获得优良种子。菌种稳定性的检查菌种稳定性的检查无（杂菌）检查无（杂菌）检查第71页/共92页五、生产发酵罐的无菌接种技术生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：生
41、产规模发酵罐的接种，包括两个方面：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐；入一个种子罐；从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。第72页/共92页压差法 接种瓶 压力差火焰封口法 在种子罐接种口周围设有沟槽，沟槽内注入少量酒精，点燃酒精使接种口被围在一圈火焰之中；在火焰圈中即可将菌悬液倒入种子罐中。第73页/共92页第74页/共92页第75页/共92页第76页/共92页第77页/共92页第78页/共92页 从种子罐到发酵罐的接种，是通过接种管道，在压力作用下进行的。第79页/共92页从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种从实验
42、室摇瓶或孢子悬浮液容器接种第80页/共92页从种子罐接种从种子罐接种第81页/共92页第二节 实例一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵罐1、斜面菌种的培养菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。(1)斜面培养基组成 葡萄糖 0.1 蛋白陈 1.0 牛肉膏 1.0 氯化钠 0.5 琼脂 2.02.5 PH 7.0 7.2 （传代和保藏斜面不加葡萄糖）(2)培养条件：3334，培养1824h。第82页/共92页2、一级种子培养一级种子培养的目的在于大量繁殖
43、活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。(1)培养基组成葡萄糖 2.5 尿素 0.5硫酸镁 0.04 磷酸氢二钾 0.1玉米浆 2.53.5(按质增减)硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppmPH 70第83页/共92页(2)培养条件 用1000mL三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程7.6cm、频率96次min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度3334(3)一级种子质量要求种龄：12h pH值：6.4 0.1光密度：净增OD值0.5以上残糖：0.5以下 无菌检查：(-)噬菌体检查：(-)镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐革兰氏阳性反应。第84页/共92页
44、3、二级种子培养为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。(1)培养基组成第85页/共92页(2)培养条件 接种量：0.81.0 培养温度：3234 培养时间：78h 通风量50L种子罐1:0.5搅拌转速340rmin；250L种子罐1:0.3搅拌转速300r min500L种子罐1:0.25搅拌转速230r min第86页/共92页(3)二级种子的质量要求种龄 78h pH 7.2左右OD值 净增0.5左右无菌检查 (-)噬菌体检查(-)第87页/共92页二、啤酒酵母的扩大培养一般可采用三级扩大培养，扩
45、大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。1、实验室扩大培养第88页/共92页2，车间扩大培养第89页/共92页The End第90页/共92页种子罐的级数越多好还是越少好？种子罐的级数越多好还是越少好？种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐最终代谢产物积累的时间，缩短由于种子发芽、的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐最终代谢产物积累的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。生长而占用的非生产时间，以提高发酵
46、罐的生产率。问题问题1问题问题2什么叫接种龄？以什么接种龄接种较好？什么叫接种龄？以什么接种龄接种较好？指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常接种龄以通常接种龄以菌丝处于生命极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体尚未达到最高峰时较为合适。对于菌丝处于生命极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体尚未达到最高峰时较为合适。对于年轻的种子接入发酵罐后往往会出现前期生长缓慢，整个发酵周期延长；过老的种子会引年轻的种子接入发酵罐后往往会出现前期生长缓慢，整个发酵周期延长；过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶。起
47、生产能力下降而菌丝过早自溶。问题问题3什么叫接种量？以什么接种量接种较好？什么叫接种量？以什么接种量接种较好？指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。如大多数抗生素发酵的最适接种如大多数抗生素发酵的最适接种量为量为7%-15%，由棒状杆菌进行谷氨酸发酵的接种量只需用，由棒状杆菌进行谷氨酸发酵的接种量只需用1%。采用较大的接种量可以。采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液粘度增加，造成溶解氧供应不足而影响产物的合成。快，培养液粘度增加，造成溶解氧供应不足而影响产物的合成。第91页/共92页感谢您的观看！第92页/共92页