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1、本 章 内 容第一节第一节 植物组织培养植物组织培养第二节第二节 植物胚胎培养植物胚胎培养第三节第三节 毛状根培养毛状根培养第四节第四节 人工种子人工种子第五节第五节 植物脱毒植物脱毒第1页/共52页本节课主要内容1.毛状根培养制备次级代谢产物2.人工种子的制备本节课关键问题1.毛状根的诱导机制与方法、应用，2.人工种子的制备第2页/共52页一、毛状根培养生产次级代谢产物一些植物的次级代谢产物在根里大量合成，但是正常根的培养非常困难，生长缓慢，收获困难。毛状根(hairy roots)是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶植物后，形成的类似头发一样的根组织。
2、许多植物的毛状根在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力，产物产量较正常植物及悬浮培养细胞的要高。第三节 毛状根培养第3页/共52页1.1.毛状根诱导发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。发根农杆菌具有致根性，是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri(Root）,inducing)质粒（约250kb的大质粒）是位于发根农杆菌染色体之外的独立的双链环状DNA。具有2个主要的功能区：T-DNA区(Transferred DNA region，转移区)和Vir区(Vi
3、rulanee region，致病区)。第4页/共52页在通常状态下，Ri质粒上Vir区的基因处于抑制状态，当发根农杆菌感染寄主植物时，受损伤的植物细胞合成的低分子苯酚化合物乙酰丁香酮使Vir区处于抑制状态的基因被激活，产生一系列限制性核酸内切酶，在酶的切割作用下产生T-DNA链，T-DNA进入植物细胞核内，整合进植物细胞的基因组。其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。T-DNA上有生长素合成基因tms 1和tms 2，指导IAA(吲哚乙酸)的合成，因此转化产生的毛状根，在培养时不需要添加外源生长激素，为激素自养型。第5页/共52页2.毛状根诱导方法（1）外植体接种法取植物的叶片、茎段、叶
4、柄等无菌外植体，与发根农杆菌共同培养23天，将植物的外植体移到含有抗生素的选择培养基上进行培养，经过多次继代培养，转化的植物细胞产生愈伤组织，并可产生毛状根。第6页/共52页（2）茎杆接种法无菌植株生长到一定时候，将植株的茎尖、叶片切去，剩下茎杆和根部，在茎杆上划出伤口，将带Ri质粒的发根农杆菌接种在伤口处和茎的顶部切口处，经过一段时间培养，在接种部位产生毛状根。第7页/共52页（3）原生质体农杆菌共培养法将原生质体培养3-5天后，加入带Ri质粒的发根农杆菌进行共培养，然后借助于转化后的细胞激素自养型特性或T-DNA上的抗菌素标记筛选出转化成功的细胞。分裂形成愈伤组织，在无激素培养基上可产生毛
5、状根。第8页/共52页3.毛状根培养优点由Ri质粒转化的毛状根生长快、激素自养型、生长周期短，在培养时不需要添加外源激素，易于培养。毛状根分化程度高，产生次级代谢产物能力强，合成较为稳定，能大量合成某些悬浮培养的细胞不能或者很少合成的次级代谢产物。通过T-DNA改造，易于采用基因工程途径提高次级代谢产物产量。第9页/共52页4.毛状根在药用次生代谢产物中的应用毛状根应用于药用植物次生代谢产物的生产已有近30年的历史。黄酮类(flavonoids)：付春祥等的研究表明。来源于新疆雪莲根段外植体的毛状根系。其20d的生长速率可达到鲜重接种量的24倍。其中黄酮含量是野生雪莲根的8.6倍，是野生雪莲叶
6、片的2.9倍。第10页/共52页生物碱类(alkaloids)：孙敏等以长春花(Catharanthus roseus)无菌苗叶片为外植体诱导毛状根，其中长春碱含量是原植物根和叶中含量的27.4倍和23.5倍。长春新碱的含量是原植物根是23.55倍。蒽醌类(anthraquinones):对何首乌(Polygoniummultiflorum Thunb)的研究表明：以再生植株的叶柄、茎段和叶片为外植体可诱导毛状根，毛状根中大黄酸的含量为2.49g/L(干重)。是无菌幼苗的2.85倍。第11页/共52页皂苷类(saponins)：对人参的研究表明：以无菌苗带叶幼茎为外植体诱导的毛状根中人参总皂苷
7、含量为2.486(干重)。高于原药材总皂苷含量1.403(干重)。苯丙素类(类(phenyIpropanoids)：雪莲毛状根中丁香苷和高车前素的含量分别约是野生植株的40倍和3倍。萜类(terpenoids)：对短叶红豆杉的研究表明：以无菌苗的芽为外植体可诱导出毛状根。毛状根中紫杉醇的含量为愈伤组织的1 3-88.00倍。第12页/共52页5.毛状根培养的生物反应器毛状根外型像毛发，容易交织缠绕。毛状根的特点决定了用于毛状根培养的生物反应器需要特殊设计。例如：反应器的内部需要特殊设计满足毛状根的空间分布的均匀性问题。同时，也要提供合适的培养液循环与气体供给方式才能满足毛状根对营养和气体的需求
8、，还要考虑接种、取样、收获、生物量检测等特殊问题。第13页/共52页传统反应器改造在搅拌式反应器中用丝网把毛状根与叶轮隔开，避免了叶轮剪切力的影响。在鼓泡塔反应器中增加大量的喷头，提高了充氧效率。第14页/共52页新型反应器设计:超声雾化反应器1 生物反应器 2 中心筒 3 不锈钢筛网 4 空气出口 5 时间继电器 6 雾化头 7 培养液 8 空气入口9 空气过滤器 10 流量计 11 电磁阀 12 空气储罐 13 雾化装置 14 40W 日光灯第15页/共52页第四节 人工种子一、一、人工种子概念与发展状况人工种子概念与发展状况二、二、人工种子制作人工种子制作三、三、人工种子储存人工种子储存
9、四、四、人工种子优点及存在问题人工种子优点及存在问题第16页/共52页 人工种子（Artificial seed）：又称合成种子(Synthetic seed)或体细胞种子(Somatic seed)，是指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳(Artificial endosperm)和人工种皮(Artificial seed coat)中形成的类似种子的颗粒。一、人工种子概念与发展状况第17页/共52页 结构上从外向里包括三部分：（1）人工种皮外层，保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；（2）人工胚乳，含有必需的营养成分和某些植物激素；（3）胚状体或芽。
10、双子叶植物：蓖麻种子结构单子叶植物：小麦颖果的结构一、人工种子概念与发展状况第18页/共52页l穆拉希吉（Murashige）1978年在第四届国际植物组织培养大会上首次提出研制人工种子的设想。l从20世纪80年代开始，美、日、法竞相掀起人工种子研制的热潮。我国在1987年也将人工种子的研究列入高技术发展计划（863计划）。l国外已研制成胡萝卜、苜蓿、芹菜、花椰菜、莴苣、花旗松、天竺葵等植物的人工种子。l我国继1988年在国际上首次研制成功水稻人工种子后，研制成了旱芹、花椰莱、杂交水稻等许多种作物的人工种子。一、人工种子概念与发展状况第19页/共52页 （1）胚状体同步发育高质量和高数量的胚状
11、体是大量制备人工种子的基础。控制胚状体发育的同步化是人工种子制备的核心之一，主要方法如下：l抑制剂法：在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如5-氨基尿嘧啶），一旦去除抑制剂后细胞可以同步发育。l低温法：低温处理抑制细胞分裂，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步化。二、人工种子制作第20页/共52页l渗透压法：不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。l通气法：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通过在培养基中通入乙烯或氮气控制细胞同步分裂。l分离筛选法：用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同
12、发育期的胚状体。第21页/共52页（2）人工种皮制作 理想的人工种皮(Artifical seed coat)应该具有保护胚状体的功能，并且具有无毒、良好的通气性、抗污染、适合运输等特点。最早采用的材料是聚氧乙烯，但是具有一定毒性、易溶解于水等不足。目前采用海藻酸盐较多，其具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性低、成本低廉等优点。但是也存在一些缺点，例如：水性营养成分易流失、表面易结团等。因此，开发理想的人工种皮材料仍是一个重要课题。第22页/共52页（3）人工胚乳配制 人工胚乳(Artifical endosperm)主要包括无机盐、碳水化合物、蛋白质等（培养基组分）。是胚胎发育的营养保
13、证。由于糖等物质的存在易导致微生物污染，所以还要加入防腐剂、抗菌素、农药等成分。第23页/共52页藻酸钠等水溶性凝胶与Ca2+进行离子交换后凝固（4）包埋 包埋是人工种子制作的重要一环。方法主要有以下两种：干燥法：这是比较早的一种包埋方法。将胚状体置于23、70%左右相对湿度、黑暗条件下逐渐干燥，然后用聚氧乙烯等种皮材料包裹。水凝胶法：这是目前比较常用的一种方法。用海的特点包埋单个胚状体或芽。种子硬度由凝胶浓度与络合时间控制。第24页/共52页海藻酸钠包埋示意图包埋液（人工胚乳）制备：2%-3%的海藻酸钠+营养物、生长因子等。将成熟的体细胞胚胎与包被液相混合，然后将其滴入（只允许一个通过）适当
14、浓度的氯化钙溶液中，经过络合作用（生成海藻酸钙）的造形过程，在20-30分钟内形成内含细胞胚、有一定硬度的雏形人工种子。第25页/共52页贮藏与发芽一般将人工种子贮藏在47低温、相对湿度小于67%的条件下。实际上随贮藏时间的延长,人工种子的萌发率会显著下降。三、人工种子储存第26页/共52页1、人工种子的优点 （1）便于运输和储藏（相对于试管苗）。（2）人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分，使人工种子优越于天然种子。（3）可以固定杂种优势，加速良种繁育。（4）可作为植物基因工程和遗传工程的载体。（5）可保存珍贵稀有植物品种。（6）大规模繁殖植物（尤其是
15、没有种子和种子昂贵的植物）四、人工种子优点及存在问题第27页/共52页2.存在的问题 （1）人工种皮性能不尽人意。（2）还没有一种符合多数植物胚状体需要的人工胚乳。（3）胚状体储藏阶段的休眠控制；（4）如何保证长期储藏而又不影响萌发率；（5）制作流程较繁琐、成本高。（6）许多植物还不能成功地诱导出高质量体细胞胚。第28页/共52页举例：一品红人工种子制作为什么要制备人工种子：一品红又名圣诞花，属大戟科。是在元旦和圣诞节前夕观赏的一种著名盆栽花卉。一品红常采用扦插繁殖，繁殖速度慢。如何制备人工种子：器官发生途径：目前多以叶片、茎段为外植体诱导愈伤组织，再分步诱导芽和根，生成苗。体细胞胚途径：以苞
16、片为外植体，离体诱导体细胞胚，制作人工种子。下面介绍这种方法。注意不同生长素/分裂素比例对于体细胞胚诱导的影响。第29页/共52页（1）愈伤组织诱导：将一品红苞片常规消毒，切成0.6cm2小块，接种到添加不同浓度6-BA和2，4-D的MS培养基中（表1），每瓶接种5片称重，第20天继代培养时再称重。培养温度25度左右，暗培养。第30页/共52页2，4-D/6-BA比例较高时(2.0/0.5)有利于愈伤组织诱导2，4-D：2，4-二氯苯氧乙酸（生长素）6-BA：6-苄基腺嘌呤（分裂素）第31页/共52页（2）体细胞胚诱导降低生长素2，4-D浓度(1.0/0.5)：体细胞胚分化率升高活性炭吸附减轻
17、酚氧化的褐变，也有促进萌发效果第32页/共52页 （3 3）包埋与萌发海藻酸盐法胚状体悬浮在3%的海藻酸钠+1/2MS培养基+6-BA0.5mg/L（分裂素）+GA3(赤霉素)0.5mg/L+IBA0.5mg/L（生长素）+1.5%麦芽糖的混合液中(赤霉素是生长调节剂，能促进不定胚发育成小植株)滴入到2%氯化钙溶液里，络合15分钟，捞起，无菌水洗涤，干燥成一定强度的人工种子胶丸。播种在无激素的MS培养基上，25度，光照2000lx，12小时/天，30天后计算萌发率。1球形胚2心形胚3犁形胚6人工种4子叶期胚 5人工种子子萌发第33页/共52页 第五节 植物脱毒一、一、植物脱毒的概念植物脱毒的概
18、念二、二、植物脱毒方法植物脱毒方法三、三、脱毒植物鉴定脱毒植物鉴定第34页/共52页1943年，white在体外培养感染了烟草花叶病毒（TMV）的马铃薯，并用枯斑寄主法测定了其根不同部位的病毒含量，发现根尖部位的病毒含量比其他部位少，甚至不存在病毒。随着往成熟区的推移，病毒含量越来越高。这一发现为茎尖培养脱除病毒提供了理论依据。第35页/共52页黄瓜花叶病毒（CMV）百合丛簇病（CTLV）郁金香条斑病毒（TuBV）第36页/共52页甘薯羽状斑驳病毒甘薯明脉病毒 第37页/共52页番茄黄瓜花叶病毒病症水稻矮缩病症第38页/共52页一、植物脱毒概念植物脱毒（virus elimination）是利
19、用物理、化学、生物学方法脱除植物所感染的病毒，在无菌条件下培养不带病毒的植株，进行快速繁育无病毒种苗的技术。第39页/共52页（一）物理方法1、高温处理法 脱毒原理：一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40）易钝化失活，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。（1）温汤浸渍处理脱毒法 材料置于50左右热水中浸渍几十分钟到数小时。特点：简单易行，成本低，但易使材料受伤。适用：甘蔗、木本植物和休眠器官的处理。（2）热空气处理脱毒法 将植物用3540的热空气处理24周或更长时间。特点：损伤较小，操作简便，须严格控制温度时间 适用：多数植物 二、植物脱毒方法第40页/共52页 热处理脱毒法优缺点
20、 优点：优点：要求的设备条件比较简单，脱毒操作也比较容易。缺点：缺点：脱毒时间长，脱毒不完全；对球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效，对杆状和线状病毒的作用不大。热处理后只有一小部分植株能够存活。第41页/共52页2、低温处理法 低温处理又称冷疗法，降低温度能使病毒活力下降。第42页/共52页（二）化学方法 抑制植物体内病毒的复制。常用的化学药品有放线菌酮、三氯唑核苷、孔雀绿、硫脲嘧啶、8-氮鸟嘌呤。优点：抑制病毒复制。缺点：不能使病毒失活，并对植物有毒害作用。第43页/共52页（三）生物方法 1.茎尖培养 有效的植物脱毒方法。茎尖通常取材0.2-0.5mm大小。茎尖培养结合
21、高温处理法脱毒效果进一步提高。优点：周期短，效率高。缺点：茎尖小，营养、水分含量低，对培养基要求高，剥离技术要求也越高，植物的存活率低。n茎尖脱毒培养的两个关键技术环节是茎尖的成活率和脱毒率。第44页/共52页热处理结合茎尖脱毒培养第45页/共52页龙牙百合茎尖茎尖的分化龙牙百合小苗第46页/共52页2.茎尖微体嫁接脱毒木本植物茎尖培养难以生根形成植株。为了克服这个困难，可将实生苗砧木培育在培养基上，再从成年无病毒树枝上切取茎尖（0.14-1.0mm），在砧木切断面上进行试管微体嫁接，就可获得无病毒的幼苗。利用这个方法，柑橘类嫁接成活率为30%-50%，移栽成活率约95%，嫁接两年后即可结实。
22、第47页/共52页3.愈伤组织脱毒 植物器官或组织经诱导产生愈伤组织，再分化培养长成小植株。由无病毒细胞产生的愈伤组织可以获得无病毒苗。有些愈伤组织细胞病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂过程中，病毒的复制能力衰退或丢失，因此也可以获得无菌苗。第48页/共52页 4.珠心胚培养脱毒l柑橘类多胚品种中除了一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株全部均无病毒。但珠心胚大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。l珠心胚培养技术对除去柑橘主要病毒，如引起银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都十分有效。5.花药培养脱毒花药培养获得单倍体植株，再通过染色体加倍可获得无病毒植株。第49页/共52页（一）直接检测法（二）指示植物法 1、摩擦接种法 2、嫁接法（三）电镜法（四）抗血清检测法（五）分子检测技术 三、脱毒植物鉴定第50页/共52页小结:掌握毛状根的诱导机制，人工种子的概念及组成，人工种子的制备方法，关键是体细胞胚的培育；熟悉毛状根培养生产次级代谢产物的方法；了解毛状根培养生物反应器，植物脱毒技术。第51页/共52页感谢您的观看！第52页/共52页