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1、第六章蛋白质工程原理及其在食品加工中的应用第一节第一节 蛋白质工程的原理和方法蛋白质工程的原理和方法 以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用遗传工程的以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成基方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。类服务的一种生物技术。一、蛋白质工程的概念一、蛋白质工程的概念一、蛋白质工程的概念一
2、、蛋白质工程的概念 天然的正常构象是蛋白质的最佳状态，它既能高效地天然的正常构象是蛋白质的最佳状态，它既能高效地发挥功能，又便于机体的正常调控，因而极易失活而中止发挥功能，又便于机体的正常调控，因而极易失活而中止作用。但在生物体外，特别是工业化的粗放生产条件下，作用。但在生物体外，特别是工业化的粗放生产条件下，这种可被灵敏调节的特性就表现为酶分子性质的极不稳定这种可被灵敏调节的特性就表现为酶分子性质的极不稳定性，导致难以持续发挥应有的功能，成为限制其推广应用性，导致难以持续发挥应有的功能，成为限制其推广应用的主要原因。如温度、压力、机械力、重金属、有机溶剂、的主要原因。如温度、压力、机械力、重
3、金属、有机溶剂、氧化剂以及极端氧化剂以及极端pHpH值等都会影响它的作用。值等都会影响它的作用。蛋白质工程技术针对这一现状，对天然蛋白质进行改蛋白质工程技术针对这一现状，对天然蛋白质进行改造改良或全新设计模拟，使目的蛋白质具有特殊的结构和造改良或全新设计模拟，使目的蛋白质具有特殊的结构和性质，能够抵御外界的不良环境，即使在极端恶劣条件下性质，能够抵御外界的不良环境，即使在极端恶劣条件下也能继续发挥作用，因而蛋白质工程具有广阔的应用前景。也能继续发挥作用，因而蛋白质工程具有广阔的应用前景。主要包括：主要包括：分子遗传学分子遗传学分子遗传学分子遗传学、蛋白质结构功能蛋白质结构功能蛋白质结构功能蛋白
4、质结构功能相关的理论相关的理论与技术。与技术。分子遗传学分子遗传学分子遗传学分子遗传学：完整：完整cDNAcDNA的克隆技术、的克隆技术、DNADNA序列的快速序列的快速测定技术、测定技术、DNADNA序列推测蛋白质序列的多维程序系统、原序列推测蛋白质序列的多维程序系统、原核生物及真核生物基因表达过程的调控、基因的定位诱变核生物及真核生物基因表达过程的调控、基因的定位诱变及随机诱变理论与技术等。及随机诱变理论与技术等。蛋白质结构功能分析蛋白质结构功能分析蛋白质结构功能分析蛋白质结构功能分析：蛋白质一级结构氨基酸序列：蛋白质一级结构氨基酸序列的分析；的分析；X X光单晶衍射结构分析技术；两维和三
5、维核磁共光单晶衍射结构分析技术；两维和三维核磁共振结构分析技术；蛋白质结构数据库的建立；蛋白质功能振结构分析技术；蛋白质结构数据库的建立；蛋白质功能的酶学和免疫研究技术；蛋白质分子力场、能态、自由能的酶学和免疫研究技术；蛋白质分子力场、能态、自由能等生物物理学研究技术；计算机模拟处理结构分析系统等。等生物物理学研究技术；计算机模拟处理结构分析系统等。两大类理论与技术相互关联、相互促进，借助其他两大类理论与技术相互关联、相互促进，借助其他多类学科的支持，完成对蛋白质分子结构与功能分析、多类学科的支持，完成对蛋白质分子结构与功能分析、归类，进一步展开突变蛋白质的分子模拟与预测，实现归类，进一步展开
6、突变蛋白质的分子模拟与预测，实现蛋白质的改造，以及全新蛋白质的分子结构与功能的设蛋白质的改造，以及全新蛋白质的分子结构与功能的设计，在计算机模拟的基础上，进行蛋白质分子的化学修计，在计算机模拟的基础上，进行蛋白质分子的化学修饰、合成的实际操作，验证分子设计的结果，获得具有饰、合成的实际操作，验证分子设计的结果，获得具有特定结构、性质和功能的目的蛋白质。特定结构、性质和功能的目的蛋白质。二、蛋白质工程的原理二、蛋白质工程的原理二、蛋白质工程的原理二、蛋白质工程的原理（一）蛋白质工程的（一）蛋白质工程的（一）蛋白质工程的（一）蛋白质工程的目的目的目的目的 对目的蛋白质进行结构和功能上的设计与改造，
7、以满对目的蛋白质进行结构和功能上的设计与改造，以满足人们特定条件下的需要。以蛋白质结构与功能的研究为足人们特定条件下的需要。以蛋白质结构与功能的研究为基础，掌握蛋白质活性中心的结构，包括催化中心和调节基础，掌握蛋白质活性中心的结构，包括催化中心和调节中心的空间构象，了解构成中心的各氨基酸残基及其侧链中心的空间构象，了解构成中心的各氨基酸残基及其侧链基团的位置，再借助计算机图像与处理系统的模拟进行分基团的位置，再借助计算机图像与处理系统的模拟进行分子辅助设计，提出对目的蛋白质的改建或构建方案，确定子辅助设计，提出对目的蛋白质的改建或构建方案，确定活性中心的氨基酸残基组成，并辅助设计和预测其结构功
8、活性中心的氨基酸残基组成，并辅助设计和预测其结构功能的变化。能的变化。（二）蛋白质工程的组成部分（二）蛋白质工程的组成部分（二）蛋白质工程的组成部分（二）蛋白质工程的组成部分 1.1.蛋白质放大扩增系统蛋白质放大扩增系统 由由组组织织提提取取的的少少量量纯纯化化的的蛋蛋白白质质，通通常常只只有有mgmg。作作为为出出发发蛋蛋白白质质分分子子，先先解解析析部部分分肽肽段段的的一一级级结结构构，根根据据遗遗传传密密码码设设计计并并合合成成相相应应的的同同位位素素标标记记寡寡聚聚核核苷苷酸酸片片段段，再再由由此此从从基基因因文文库库中中调调出出该该蛋蛋白白质质的的克克隆隆化化基基因因，转转入入DNA
9、DNA序序列列分分析析系系统统测测定定DNADNA序序列列并并克克隆隆化化，最最后后通通过过表表达达载载体体系系统统扩扩增增蛋蛋白白质质的的量量，达达到到能能够够分分析析出出发发蛋蛋白白质质的的结结构构功功能能的水平，通常需要蛋白质量为的水平，通常需要蛋白质量为g g。2.2.蛋白质结构功能分析及分子设计系统蛋白质结构功能分析及分子设计系统 由上一系统获得足量的出发蛋白质后，通过目前已经由上一系统获得足量的出发蛋白质后，通过目前已经具备的蛋白质结构分析方法，分析蛋白质的一级结构和空具备的蛋白质结构分析方法，分析蛋白质的一级结构和空间结构。间结构。X X X X光衍射分析晶体蛋白质的结构光衍射分
10、析晶体蛋白质的结构光衍射分析晶体蛋白质的结构光衍射分析晶体蛋白质的结构，而，而三维核磁共振三维核磁共振三维核磁共振三维核磁共振法研究溶液中的蛋白质结构法研究溶液中的蛋白质结构法研究溶液中的蛋白质结构法研究溶液中的蛋白质结构，同时研究该蛋白质结构与功，同时研究该蛋白质结构与功能的关系，并将结果输入计算机图像处理系统和结构处理能的关系，并将结果输入计算机图像处理系统和结构处理系统，根据生物物理学原理以及已知蛋白质结构功能数据系统，根据生物物理学原理以及已知蛋白质结构功能数据库的基本规律，从结构与功能研究出发，进行分子结构分库的基本规律，从结构与功能研究出发，进行分子结构分析与模拟，进一步辅助设计和
11、功能预测，提出分子的预期析与模拟，进一步辅助设计和功能预测，提出分子的预期性质、改造或构建方案，完成突变蛋白质的分子设计或构性质、改造或构建方案，完成突变蛋白质的分子设计或构建过程。建过程。3.3.突变蛋白质的合成表达系统突变蛋白质的合成表达系统 将突变方案通过分子遗传学方法实施即蛋白质的定点将突变方案通过分子遗传学方法实施即蛋白质的定点突变技术，改造或构建方案通过合成突变寡聚核苷酸，引突变技术，改造或构建方案通过合成突变寡聚核苷酸，引入定位突变，或采用其他方法引入突变，并进入克隆系统入定位突变，或采用其他方法引入突变，并进入克隆系统分离出突变分离出突变DNADNA，以此作为模板，引入载体表达
12、系统，扩增，以此作为模板，引入载体表达系统，扩增表达获得大量的突变蛋白质。对获得的突变蛋白质进行结表达获得大量的突变蛋白质。对获得的突变蛋白质进行结构、性质和功能的分析、测试与判定，如符合分子设计的构、性质和功能的分析、测试与判定，如符合分子设计的要求，则获得目的蛋白质；如不能满足实际要求，则再由要求，则获得目的蛋白质；如不能满足实际要求，则再由分子设计系统重新指导设计，进入新一轮循环，最终获得分子设计系统重新指导设计，进入新一轮循环，最终获得满足人们要求的目的蛋白质。满足人们要求的目的蛋白质。（三）蛋白质工程操作中的问题（三）蛋白质工程操作中的问题（三）蛋白质工程操作中的问题（三）蛋白质工程
13、操作中的问题 1.1.有关分子遗传学和基因工程的问题有关分子遗传学和基因工程的问题 例如更有效的例如更有效的cDNAcDNA克隆技术，精确高效的定位突变技克隆技术，精确高效的定位突变技术，高效目的基因表达系统等。术，高效目的基因表达系统等。2.2.有关蛋白质结构功能研究的理论和技术有关蛋白质结构功能研究的理论和技术 例如准确地由一级结构推测高级结构，肽链折叠的精例如准确地由一级结构推测高级结构，肽链折叠的精确控制，蛋白质的翻译后修饰，蛋白质结构可变性，分子确控制，蛋白质的翻译后修饰，蛋白质结构可变性，分子动力学与蛋白质功能的关系，蛋白质在晶体、溶液以及细动力学与蛋白质功能的关系，蛋白质在晶体、
14、溶液以及细胞中的不同存在状态及其对蛋白质性质、功能的影响等。胞中的不同存在状态及其对蛋白质性质、功能的影响等。3.3.一些相关辅助技术一些相关辅助技术 例如微量蛋白质的纯化鉴定技术、更有效的蛋白质结例如微量蛋白质的纯化鉴定技术、更有效的蛋白质结晶方法、计算机辅助系统的有效性等。晶方法、计算机辅助系统的有效性等。三、蛋白质工程的基本步骤三、蛋白质工程的基本步骤三、蛋白质工程的基本步骤三、蛋白质工程的基本步骤 1.1.分分离离纯纯化化目目的的蛋蛋白白，使使之之结结晶晶并并作作X X晶晶体体衍衍射射分分析析，结结合合核核磁磁共共振振技技术术等等其其他他方方法法的的分分析析结结果果，得得到到其其空空间
15、间结结果尽可能多的信息。果尽可能多的信息。2.2.对目的蛋白质功能作详细的研究，确定它的功能域。对目的蛋白质功能作详细的研究，确定它的功能域。3.3.通通过过对对蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构、空空间间结结构构和和功功能能之之间间相相互关系的分析，找出关键的基团和结构。互关系的分析，找出关键的基团和结构。4.4.围围绕绕这这些些关关键键的的基基团团和和结结构构提提出出对对蛋蛋白白质质进进行行改改造造的方案，并用基因工程的方法实施。的方案，并用基因工程的方法实施。5.5.对对经经过过改改造造的的蛋蛋白白质质进进行行功功能能测测定定，看看看看改改造造的的效效果如何。果如何。6.6.重复重复4 4
16、和和5 5两个步骤，直到获得理想的结果。两个步骤，直到获得理想的结果。四、蛋白质工程的主要研究方法四、蛋白质工程的主要研究方法四、蛋白质工程的主要研究方法四、蛋白质工程的主要研究方法 1.1.蛋白质的分离纯化鉴定方法、结构分析方法、功能蛋白质的分离纯化鉴定方法、结构分析方法、功能研究方法和进行结构改造的分子生物学研究方法研究方法和进行结构改造的分子生物学研究方法 在这四类根据蛋白质工程的操作步骤而划分的主要研在这四类根据蛋白质工程的操作步骤而划分的主要研究方法中，蛋白质分离纯化鉴定方法与生物化学中的常规究方法中，蛋白质分离纯化鉴定方法与生物化学中的常规方法没有本质的区别，是对许多结构、性质相似
17、的一系列方法没有本质的区别，是对许多结构、性质相似的一系列突变蛋白质的分离、纯化和鉴定，但其难度要大得多，通突变蛋白质的分离、纯化和鉴定，但其难度要大得多，通常需要运用多种高精度的方法才能实现，如亲和层析、等常需要运用多种高精度的方法才能实现，如亲和层析、等电聚焦、免疫沉淀等。电聚焦、免疫沉淀等。2.2.蛋白质功能研究方法必须根据不同种类的蛋白质所蛋白质功能研究方法必须根据不同种类的蛋白质所具有的不同功能，相应地采用不同的研究方法具有的不同功能，相应地采用不同的研究方法 如对具有催化活性的蛋白质酶，则用酶学的稳态动如对具有催化活性的蛋白质酶，则用酶学的稳态动力学方法；对抗体则用免疫学方法；其他
18、蛋白质如激素、力学方法；对抗体则用免疫学方法；其他蛋白质如激素、生长因子、受体类以及核酸结合类蛋白质都有相应的研究生长因子、受体类以及核酸结合类蛋白质都有相应的研究方法。所有这些蛋白质功能的研究中，建立一套高效、简方法。所有这些蛋白质功能的研究中，建立一套高效、简便的蛋白质功能测定方法是成功的关键。对特定的蛋白质，便的蛋白质功能测定方法是成功的关键。对特定的蛋白质，如果能够找到特异专一性的检测方法，可以极大地提高研如果能够找到特异专一性的检测方法，可以极大地提高研究的效率。在分子生物学和蛋白质工程研究中，对不同功究的效率。在分子生物学和蛋白质工程研究中，对不同功能蛋白质特异性检测方法的研究，也
19、是重要的研究方向之能蛋白质特异性检测方法的研究，也是重要的研究方向之一。一。（一）蛋白质结构分析方法（一）蛋白质结构分析方法（一）蛋白质结构分析方法（一）蛋白质结构分析方法 蛋白质结构分析方法主要是指与研究蛋白质的空间结蛋白质结构分析方法主要是指与研究蛋白质的空间结构有关的理论与技术。构有关的理论与技术。主要包括主要包括主要包括主要包括：蛋白质一级结构（即氨基酸序列）的测定方法、蛋白蛋白质一级结构（即氨基酸序列）的测定方法、蛋白质晶体学、核磁共振法、蛋白质折叠过程研究、蛋白质生质晶体学、核磁共振法、蛋白质折叠过程研究、蛋白质生物物理研究法以及蛋白质工程的计算机辅助设计与模拟研物物理研究法以及蛋
20、白质工程的计算机辅助设计与模拟研究等。究等。1.1.蛋白质一级结构分析方法蛋白质一级结构分析方法 蛋白质一级结构研究，即氨基酸序列的测定，其原理蛋白质一级结构研究，即氨基酸序列的测定，其原理是片段重叠、逐级降解、是片段重叠、逐级降解、cDNAcDNA以及质谱法等几种，其中片以及质谱法等几种，其中片段重叠和逐级降解是最常用的方法。段重叠和逐级降解是最常用的方法。2.2.蛋白质构象研究方法蛋白质构象研究方法 在蛋白质高级结构研究方面，在蛋白质高级结构研究方面，X X光衍射和三维核磁共光衍射和三维核磁共振是蛋白质空间构象研究最主要的分析手段，分别用于对振是蛋白质空间构象研究最主要的分析手段，分别用于
21、对结晶蛋白质和溶液中蛋白质空间构象的研究。结晶蛋白质和溶液中蛋白质空间构象的研究。X X光衍射主光衍射主要对结晶蛋白质的各向基团的空间排布进行分析，对蛋白要对结晶蛋白质的各向基团的空间排布进行分析，对蛋白质分子的整体空间构架研究作用很大。而三维核磁共振可质分子的整体空间构架研究作用很大。而三维核磁共振可以直接对水溶液中的蛋白质结构进行分析，溶液中的空间以直接对水溶液中的蛋白质结构进行分析，溶液中的空间构象更接近于生物体中的自然状态，更能反映蛋白质在执构象更接近于生物体中的自然状态，更能反映蛋白质在执行功能时的实际构象状态。行功能时的实际构象状态。3.3.蛋白质折叠过程研究方法蛋白质折叠过程研究
22、方法 蛋白质折叠过程研究方法，也就是蛋白质折叠机理研蛋白质折叠过程研究方法，也就是蛋白质折叠机理研究，是蛋白质化学及分子生物学最前沿的课题之一。究，是蛋白质化学及分子生物学最前沿的课题之一。目前对蛋白质折叠研究主要通过对蛋白质变性、复性目前对蛋白质折叠研究主要通过对蛋白质变性、复性过程的热力学和动力学的研究，以及对折叠中间体的研究过程的热力学和动力学的研究，以及对折叠中间体的研究而进行。而进行。变性、复性过程反映了蛋白质中肽链的折叠、卷曲过变性、复性过程反映了蛋白质中肽链的折叠、卷曲过程。定量地观察、描述和研究蛋白质变性、复性过程，可程。定量地观察、描述和研究蛋白质变性、复性过程，可以研究肽链
23、的折叠过程。热力学研究反映了过程中的能量以研究肽链的折叠过程。热力学研究反映了过程中的能量状态，动力学研究反映了折叠、卷曲过程与时间之间的关状态，动力学研究反映了折叠、卷曲过程与时间之间的关系。通过研究折叠中间体来研究折叠途径也是一种常见的系。通过研究折叠中间体来研究折叠途径也是一种常见的方法。方法。蛋白质从天然状态到变性状态，或从伸展状态折叠到蛋白质从天然状态到变性状态，或从伸展状态折叠到天然构象，是一个渐变过程，其间必然要经过许多中间过天然构象，是一个渐变过程，其间必然要经过许多中间过渡态，那些较为稳定的过渡态是折叠过程的限速步骤，这渡态，那些较为稳定的过渡态是折叠过程的限速步骤，这种较为
24、稳定的肽链构象称为种较为稳定的肽链构象称为折叠中间体折叠中间体折叠中间体折叠中间体，它可以有效地反，它可以有效地反映蛋白质的折叠途径。尽管绝大多数折叠中间体很不稳定，映蛋白质的折叠途径。尽管绝大多数折叠中间体很不稳定，由于三维核磁共振技术的发展，加上氢交换技术及快速混由于三维核磁共振技术的发展，加上氢交换技术及快速混合技术的成熟，已经可以有效地研究这些中间体。合技术的成熟，已经可以有效地研究这些中间体。4.4.蛋白质生物物理研究方法及计算机结构模拟研究蛋白质生物物理研究方法及计算机结构模拟研究 蛋白质的结构研究方法，除了以上的实验方法以外，蛋白质的结构研究方法，除了以上的实验方法以外，理论分子
25、生物物理学方法也是重要的途径之一。随着生物理论分子生物物理学方法也是重要的途径之一。随着生物物理、化学以及数学学科的发展，特别是分子力学、分子物理、化学以及数学学科的发展，特别是分子力学、分子动力学的发展及其与计算机信息处理技术的结合与发展，动力学的发展及其与计算机信息处理技术的结合与发展，利用蛋白质分子内部及其周围环境原子之间的作用，以计利用蛋白质分子内部及其周围环境原子之间的作用，以计算机信息处理系统为工具，研究蛋白质的能量、结构、热算机信息处理系统为工具，研究蛋白质的能量、结构、热力学、动力学性质，进行蛋白质空间结构规律研究和预测，力学、动力学性质，进行蛋白质空间结构规律研究和预测，取得
26、了突破性的进展。取得了突破性的进展。理论分子物理学方法的建立，使蛋白质结构的研究摆理论分子物理学方法的建立，使蛋白质结构的研究摆脱了必须完全依赖实验过程的传统模式，开辟了利用计算脱了必须完全依赖实验过程的传统模式，开辟了利用计算机模拟研究的新思路，推动了蛋白质结构研究的进程。机模拟研究的新思路，推动了蛋白质结构研究的进程。（二）分子生物学研究方法（二）分子生物学研究方法（二）分子生物学研究方法（二）分子生物学研究方法 基因工程方法，也称分子遗传学方法，是一类涉及基因工程方法，也称分子遗传学方法，是一类涉及遗传物质基因（遗传物质基因（DNADNA）的生物学理论与操作技术，包括寡）的生物学理论与操
27、作技术，包括寡聚核苷酸（又称为寡核苷酸）片段及基因的人工合成、聚核苷酸（又称为寡核苷酸）片段及基因的人工合成、目的基因的克隆与分析、目的基因的定位诱变或随机诱目的基因的克隆与分析、目的基因的定位诱变或随机诱变、目的基因在载体系统中的高效表达等。变、目的基因在载体系统中的高效表达等。1.1.寡聚核苷酸片段及基因的人工合成寡聚核苷酸片段及基因的人工合成 由于由于DNADNA自动合成仪的广泛应用，寡聚核苷酸片段及自动合成仪的广泛应用，寡聚核苷酸片段及基因的合成，即基因的合成，即DNADNA的化学合成，现已经成为分子生物学的化学合成，现已经成为分子生物学及遗传工程、蛋白质工程研究中的常规技术手段之一。
28、及遗传工程、蛋白质工程研究中的常规技术手段之一。无论从合成寡聚核苷酸片段的长度，还是合成的总量来无论从合成寡聚核苷酸片段的长度，还是合成的总量来说，都已经达到相当的规模水平。合成的产物说，都已经达到相当的规模水平。合成的产物DNADNA片段也片段也有着多方面的用途，除合成全基因或改造基因这一基本有着多方面的用途，除合成全基因或改造基因这一基本用途外，还可用作探针筛选目标基因，作为引物用于基用途外，还可用作探针筛选目标基因，作为引物用于基因的定位诱变或聚合酶链式反应（因的定位诱变或聚合酶链式反应（PCRPCR），也可合成连接），也可合成连接接头（接头（1inker1inker）用于基因末端改造等
29、，还可以用于研究）用于基因末端改造等，还可以用于研究基因的调控及基因与其他生物大分子的相互作用。基因的调控及基因与其他生物大分子的相互作用。2.2.目的基因的克隆与分析目的基因的克隆与分析 应用于蛋白质工程中目的基因的克隆与分析技术，应用于蛋白质工程中目的基因的克隆与分析技术，与常规基因工程中的方法没有本质的差别。一般也包含与常规基因工程中的方法没有本质的差别。一般也包含下面几个基本部分：源下面几个基本部分：源DNADNA的获得；的获得；DNADNA片段与克隆载体片段与克隆载体的体外连接；重组后载体引入宿主复制放大建立克隆基的体外连接；重组后载体引入宿主复制放大建立克隆基因库；筛选基因库，获得
30、目的基因克隆；目的基因的结因库；筛选基因库，获得目的基因克隆；目的基因的结构分析。构分析。3.3.目的基因的定位诱变目的基因的定位诱变 定点突变定点突变定点突变定点突变（site-directed mutagenesissite-directed mutagenesis）技术是对）技术是对已知已知DNADNA序列的基因或基因片段中任意指定位置进行突变的序列的基因或基因片段中任意指定位置进行突变的技术。它可以按照人们的意愿在指定的位置实现核苷酸的技术。它可以按照人们的意愿在指定的位置实现核苷酸的取代、插入或缺失。取代、插入或缺失。优点优点优点优点：比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具：比使用
31、化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的优点，在蛋白质工程有突变率高、简单易行、重复性好的优点，在蛋白质工程中主要应用于需要改变的氨基酸残基位置可以预先确定的中主要应用于需要改变的氨基酸残基位置可以预先确定的情况下。情况下。目前常用的定点突变方法：目前常用的定点突变方法：寡核苷酸引物介导的定点寡核苷酸引物介导的定点寡核苷酸引物介导的定点寡核苷酸引物介导的定点突变突变突变突变、PCRPCRPCRPCR介导的定点突变介导的定点突变介导的定点突变介导的定点突变和和盒式突变盒式突变盒式突变盒式突变。（1 1）寡核苷酸引物介导的定点突变）寡核苷酸引物介导的定点突变 原理原理原理
32、原理：用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚：用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动合酶的作用下启动DNADNA分子进行复制，将引物中的突变引入分子进行复制，将引物中的突变引入到基因中（图）。到基因中（图）。步骤步骤步骤步骤：将待突变基因克隆到突变载体上。将待突变基因克隆到突变载体上。制备含制备含突变基因的单链模板。突变基因的单链模板。引物与模板退火引物与模板退火55端磷酸化的突端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的的异源双链的DNADNA。合成突变链，在合成突变链，在DNADNA聚合酶的
33、催化下，聚合酶的催化下，引物以单链引物以单链DNADNA为模板合成全民的互补链，而后由连接酶封为模板合成全民的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的闭缺口，产生闭环的异源双链的DNADNA分子。分子。转化和初步筛转化和初步筛选异源双链选异源双链DNADNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链的同源双链DNADNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因。生物学法来初步筛选突变的基因。对突变体基因进行序对突变体基因进行序列分析。列分析。缺点缺点缺点缺点：常常会产生突变效率
34、较低的现象，主要原因是：常常会产生突变效率较低的现象，主要原因是大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统所致。大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统所致。进展进展进展进展：近年来这一方法已有了许多改进，如尿嘧啶取：近年来这一方法已有了许多改进，如尿嘧啶取代法、缺口双链代法、缺口双链DNADNA法、双引物法等均是利用对大肠杆菌碱法、双引物法等均是利用对大肠杆菌碱基错配修复系统的抗性来提高突变率的。另外也有人采用基错配修复系统的抗性来提高突变率的。另外也有人采用改进的质粒作为载体，省去了单链模板的制备步骤，节省改进的质粒作为载体，省去了单链模板的制备步骤，节省了时间。了时间。（2 2）PCRPC
35、R介导的定点突变法及其改进介导的定点突变法及其改进大引物突变法大引物突变法 见书见书 （3 3）盒式突变）盒式突变 原理原理原理原理：利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷：利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成，当它们退火时，按设计要求苷酸是由两条寡核苷酸组成，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端，由于不存在异源双链的中间体，产生克隆需要的黏性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体，突变效率很高。因此重组质粒全部是突变体，突变效率很高。
36、优点优点优点优点：如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分：如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数，这对于确定蛋白质分子中不同大减少了突变需要的次数，这对于确定蛋白质分子中不同位点氨基酸的作用是非常有用的方法。特别是对蛋白质中位点氨基酸的作用是非常有用的方法。特别是对蛋白质中的指定位置的氨基酸残基，进行一系列不同氨基酸残基取的指定位置的氨基酸残基，进行一系列不同氨基酸残基取代以考察取代效果时，非常有效。代以考察取代效果时，非常有效。目的基因的定位诱变，与随机诱变一起都是体
37、外基因目的基因的定位诱变，与随机诱变一起都是体外基因诱变最常用的方法。定位诱变法对结构比较清楚的基因或诱变最常用的方法。定位诱变法对结构比较清楚的基因或蛋白质较为适合，随机诱变法则对了解较少的基因或蛋白蛋白质较为适合，随机诱变法则对了解较少的基因或蛋白质比较适用。质比较适用。随机诱变法随机诱变法随机诱变法随机诱变法不但对研究对象的基本性质要求较少，还不但对研究对象的基本性质要求较少，还能反过来帮助分析基因或蛋白质的结构，由此思路发展成能反过来帮助分析基因或蛋白质的结构，由此思路发展成分子进化工程技术，大大加快了对生物大分子人工改造的分子进化工程技术，大大加快了对生物大分子人工改造的进程。进程。
38、4.4.目的基因的高效表达系统目的基因的高效表达系统 目目的的基基因因表表达达系系统统中中，以以大大肠肠杆杆菌菌（E.coliE.coli）系系统统最最为为常常用用，许许多多原原核核和和真真核核生生物物的的基基因因均均能能在在这这一一系系统统中中实实现现高高效效表表达达。酵酵母母表表达达系系统统是是真真核核生生物物常常见见的的表表达达系系统统，除除此此之之外外，还还有有枯枯草草杆杆菌菌系系统统以以及及高高等等真真核核细细胞胞外外源源基基因因表达系统等。表达系统等。在分子生物学方法中出现了一种全新的引入突变的方在分子生物学方法中出现了一种全新的引入突变的方法，称为法，称为tRNAtRNAtRNA
39、tRNA介导蛋白质工程介导蛋白质工程介导蛋白质工程介导蛋白质工程，它是在目的基因表达过程，它是在目的基因表达过程中引入突变的方法。该方法是借助校正中引入突变的方法。该方法是借助校正tRNAtRNA定点掺入非天定点掺入非天然氨基酸，以提供蛋白质结构信息，改进蛋白质检测与分然氨基酸，以提供蛋白质结构信息，改进蛋白质检测与分离方法，甚至赋予蛋白质某些新的特性。离方法，甚至赋予蛋白质某些新的特性。五、蛋白质工程的意义与展望五、蛋白质工程的意义与展望五、蛋白质工程的意义与展望五、蛋白质工程的意义与展望 作为第二代遗传工程，蛋白质工程研究为当代生物技作为第二代遗传工程，蛋白质工程研究为当代生物技术的产业化
40、发展注入了新的生命力。它已经在蛋白质药物术的产业化发展注入了新的生命力。它已经在蛋白质药物改造、酶工程、抗体工程、分子电子器件和新型医学生物改造、酶工程、抗体工程、分子电子器件和新型医学生物材料研制中获得越来越广泛的应用。材料研制中获得越来越广泛的应用。已成功地设计并合成了以已成功地设计并合成了以-螺旋和螺旋和-折叠层为主体折叠层为主体的简单蛋白质，跨出了人工构建蛋白质的第一步。同时蛋的简单蛋白质，跨出了人工构建蛋白质的第一步。同时蛋白质工程正在推动一个从预定生物功能到期望的蛋白质结白质工程正在推动一个从预定生物功能到期望的蛋白质结构，再到编码基因及其表达的反向生物学的发展。构，再到编码基因及
41、其表达的反向生物学的发展。21 21世纪初的世纪初的2020年间蛋白质工程将处于迅速发展时期，年间蛋白质工程将处于迅速发展时期，一方面，研究方法和技术将日臻成熟；另一方面，通过与一方面，研究方法和技术将日臻成熟；另一方面，通过与基因工程的密切结合，可望获得一些有应用价值的成果。基因工程的密切结合，可望获得一些有应用价值的成果。但作为以改造通过长期自然进化产生的蛋白质为目标的高但作为以改造通过长期自然进化产生的蛋白质为目标的高新技术，蛋白质工程在实用上尚有一系列严重困难有待研新技术，蛋白质工程在实用上尚有一系列严重困难有待研究解决，在产业化的方向上将有艰难的历程。蛋白质工程究解决，在产业化的方向
42、上将有艰难的历程。蛋白质工程是希望与挑战并存、艰辛与硕果同在的崭新研究领域。是希望与挑战并存、艰辛与硕果同在的崭新研究领域。第二节第二节 蛋白质工程与食品加工蛋白质工程与食品加工 葡萄糖异构酶（葡萄糖异构酶（GIGI），又称），又称D-D-木糖异构酶，属微生木糖异构酶，属微生物酶类。物酶类。19571957年最早在嗜水假单胞菌中发现其活性，后年最早在嗜水假单胞菌中发现其活性，后来又发现近百种细菌和放线菌能合成该酶，其中绝大多来又发现近百种细菌和放线菌能合成该酶，其中绝大多数为胞内酶，只有极少数菌株能分泌胞外酶。葡萄糖异数为胞内酶，只有极少数菌株能分泌胞外酶。葡萄糖异构酶能将构酶能将D-D-葡萄
43、糖、葡萄糖、D-D-木糖和木糖和D-D-核糖等催化为相应的酮核糖等催化为相应的酮糖。在体外一定条件下，它也能催化糖。在体外一定条件下，它也能催化D-D-葡萄糖转化为果葡萄糖转化为果糖，因而成为工业上制备高果糖浆（糖，因而成为工业上制备高果糖浆（HFCSHFCS）的关键酶；）的关键酶；它还可用于含木聚糖类物质发酵生产乙醇，是一种具有它还可用于含木聚糖类物质发酵生产乙醇，是一种具有重大经济价值的工业用酶。重大经济价值的工业用酶。一、葡萄糖异构酶一、葡萄糖异构酶（EC5.3.1.5EC5.3.1.5）1967 1967年美国成功地进行了年美国成功地进行了GIGI的工业化应用，以后西方的工业化应用，以
44、后西方国家主要的淀粉加工业都转向国家主要的淀粉加工业都转向GIGI技术生产。各国又竞相利技术生产。各国又竞相利用生物高技术改造用生物高技术改造GIGI的结构、性质和功能，以提高该酶的的结构、性质和功能，以提高该酶的适应性，扩大应用领域。由于葡萄糖异构酶有较好的耐热适应性，扩大应用领域。由于葡萄糖异构酶有较好的耐热性，结构也较稳定，使它成为目前国际上公认的研究蛋白性，结构也较稳定，使它成为目前国际上公认的研究蛋白质结构与功能关系，建立完整蛋白质工程技术的最好模型质结构与功能关系，建立完整蛋白质工程技术的最好模型之一。之一。（一）葡萄糖异构酶的基本性质（一）葡萄糖异构酶的基本性质（一）葡萄糖异构酶
45、的基本性质（一）葡萄糖异构酶的基本性质 葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶能能催催化化D-D-葡葡萄萄糖糖异异构构化化生生成成D-D-果果糖糖，也也可可将将木木聚聚糖糖异异构构化化为为木木酮酮糖糖，此此外外还还能能以以D-D-核核糖糖、L-L-阿阿拉拉伯伯糖糖、L-L-鼠鼠李李糖糖及及葡葡萄萄糖糖3 3、5 5、6 6碳碳的的修修饰饰衍衍生生物物为为催催化化底底物物，但但是是它它只只能能催催化化D-D-葡葡萄萄糖糖或或D-D-木木糖糖的的-旋旋光光异异构构体体，而不能催化而不能催化-旋光异构体。旋光异构体。葡萄糖异构酶的最适温度一般在葡萄糖异构酶的最适温度一般在70-8070-80，最适，微偏，最适，微
46、偏碱性，不同种属来源的酶有一定的差别。葡萄糖异构酶的碱性，不同种属来源的酶有一定的差别。葡萄糖异构酶的最适温度、最适最适温度、最适pHpH值及稳定性还受到缓冲液种类、底物浓值及稳定性还受到缓冲液种类、底物浓度、激活剂、稳定剂及反应时间的影响。另外二价金属离度、激活剂、稳定剂及反应时间的影响。另外二价金属离子对酶活力、稳定性及酶的专一性都有影响。子对酶活力、稳定性及酶的专一性都有影响。各种属来源的葡萄糖异构酶在结构上都有一定的相似各种属来源的葡萄糖异构酶在结构上都有一定的相似性。其一级结构的同源性随种属关系远近不同而不同。但性。其一级结构的同源性随种属关系远近不同而不同。但有有4040个恒定氨基
47、酸残基，其中包括个恒定氨基酸残基，其中包括1414个残基与酶活性中心个残基与酶活性中心有关。葡萄糖异构酶晶体的空间结构一般都是紧密的四聚有关。葡萄糖异构酶晶体的空间结构一般都是紧密的四聚体，单体相对分子质量约体，单体相对分子质量约4 4万万-5-5万，单体间符合万，单体间符合222222点对称点对称分布。单体由一大一小两个结构域构成，近分布。单体由一大一小两个结构域构成，近N N端的主结构端的主结构域是由域是由8 8股右手的股右手的/型桶构成，两个同轴圆柱中，内柱型桶构成，两个同轴圆柱中，内柱由由8 8条平行的条平行的-折叠股构成，外柱由折叠股构成，外柱由8 8股与股与-折叠交替相折叠交替相邻
48、邻-的螺旋构成的螺旋构成,-,-螺旋与螺旋与-折叠构成反平行；折叠构成反平行；C C端的端的小结构域由几段小结构域由几段-螺旋无规则卷曲成一个远离螺旋无规则卷曲成一个远离N N端的环状端的环状结构，参与单体内的相互作用及活性部位的构成（结构，参与单体内的相互作用及活性部位的构成（图图图图）。）。葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶的的活活性性中中心心位位于于每每个个单单体体平平行行桶桶近近C C端端的的口口部部，是是深深陷陷的的口口袋袋状状，有有两两个个二二价价金金属属离离子子结结合合位位点点，与与保保守守的的氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链基基团团以以及及溶溶剂剂中中的的氧氧原原子子形形成成配配位位键键，周
49、周围围有有一一个个高高度度疏疏水水背背景景区区，构构成成的的氨氨基基酸酸侧侧链链不不只只由由一一个个单单体体提提供供，两两个个单单体体相相聚聚成成无无活活性性或或活活性性微微弱弱的的二二聚聚体体，只只有有形形成成四四聚聚体体时时才才具具有有全全部部酶酶活活。葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶的的催催化化作作用用采采用用的的是是金金属属离离子子介介导导的的负负氢氢离离子子转转移移机制（机制（图图图图）。）。葡萄糖异构酶的基因组织和调控主要是由木糖操纵子葡萄糖异构酶的基因组织和调控主要是由木糖操纵子控制。由木糖透性酶基因（控制。由木糖透性酶基因（xyltxylt）、木糖异构酶基因）、木糖异构酶基因（xyla
50、xyla）、木糖激酶基因（）、木糖激酶基因（xylbxylb）和调节基因（）和调节基因（xylrxylr）构）构成木糖操纵子的主要成分。成木糖操纵子的主要成分。（二）葡萄糖异构酶的蛋白质工程（二）葡萄糖异构酶的蛋白质工程（二）葡萄糖异构酶的蛋白质工程（二）葡萄糖异构酶的蛋白质工程 直接发酵生产的直接发酵生产的GIGI应用在工业生产中，已经取得了令应用在工业生产中，已经取得了令人瞩目的成功，但仍存在一定局限性，如最适人瞩目的成功，但仍存在一定局限性，如最适pHpH值为碱性、值为碱性、高温下稳定性还有待提高等。偏碱性条件下糖不稳定易焦高温下稳定性还有待提高等。偏碱性条件下糖不稳定易焦化，使总产率下