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1、SDSPAGE 电泳得基本原理及浓缩胶浓缩样品得原理 SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)就是目前最常用得分离蛋白质得电泳技术 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,就是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS,SDS 能断裂分子内与分子间氢键,破坏蛋白质得二级与三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间得二硫键断裂,蛋白质在一定浓度得含有强还原剂得 SDS 溶液中,与 SDS 分子按比例结合,形成带负电荷得 SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量得 SDS,使蛋白质丧失了原有得电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征得负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然得电荷差异,由于 SDS 与
2、蛋白质得结合就是按重量成比例得,因此在进行电泳时,蛋白质分子得迁移速度取决于分子大小。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时,蛋白质得迁移率与分子量得对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW 为分子量,X 为迁移率,k、b 均为常数,若将已知分子量得标准蛋白质得迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它得电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS-PAGE 电泳成功得关键就是什么？溶液中 SDS 单体得浓度 SDS 在水溶液中就是以单体与 SDS-多肽胶束得混合形式存在,能与蛋白质分子结合得就是单体。为了保证蛋白质与 SDS 得
3、充分结合,它们得重量比应该为 14 或 13。样品缓冲液得离子强度 因为 SDS 结合到蛋白质上得量仅仅取决于平衡时 SDS 单体得浓度,不就是总浓度,而只有在低离子强度得溶液中,SDS 单体才具有较高得平衡浓度。所以,SDS 电泳得样品缓冲液离子强度较低,常为 10-100 mM。二硫键就是否完全被还原 只有二硫键被完全还原以后,蛋白质分子才能被解聚,SDS 才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率与分子质量对数得线性关系。Sample buffer 中得-巯基乙醇得浓度常为 4-5%,二硫苏糖醇得浓度常为2-3%。前者有挥发性,最好使用前加入。SDS-PAGE 缓冲液系统得选择,Tris-
4、Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐或者其她？一般来说,在被分析得蛋白质稳定得 pH 范围,凡就是不与 SDS 发生相互作用得缓冲液都可以使用,但缓冲液得选择对蛋白带得分离与电泳得速度就是非常关键得。Tris-甘氨酸系统就是目前使用最多得缓冲系统。Tris-甘氨酸系统就是目前使用最多得缓冲系统。如果要测定糖蛋白得分子量,最好采用 Tris-硼酸盐缓冲系统,对于分子质量小于 15 kDa得蛋白样品,可以使用SDS-尿素系统,也可以采用Tris-tricine缓冲系统。积层胶(或称浓缩胶)得作用原理？在缓冲系统中得弱酸,如甘氨酸,在 pH6、7 时很少解离,其有效泳动速率很低
5、,而氯离子却有很高得泳动速率,蛋白质得泳动速率介于两者之间。加上电压以后,作为先导离子得氯离子与尾随离子得甘氨酸离子分离开来,并在其后面留下一个导电性较低得区带。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便获得较高得电压梯度,加速甘氨酸离子得泳动,使其赶上氯离子,建立起甘氨酸与氯离子得电压梯度与泳动速率乘积相等得稳定态(我不太明白这句话),使这些带电颗粒以相同得速度泳动,两种离子之间有明显得边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时,在移动界面前有一低电压梯度,界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前得蛋白质分子泳动速率比氯离子低,因此氯离子能迅速越过。移动界面后得蛋白质处于较高得电压梯度中,其泳
6、动速率比甘氨酸快。因此,移动得界面将蛋白质分子堆积到一起,形成一条狭窄得区带。蛋白质在移动界面中得浓度作用仅取决于样品与浓缩胶中 Tris-HCl 得浓度(为什么？),而与样品中蛋白质得最初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶,故对蛋白样品没有分子筛作用。当移动得界面到达浓缩胶与分离胶得界面时,凝胶得 pH 明显增加,导致甘氨酸大量解离。此时,甘氨酸得有效泳动速率明显增加,超越蛋白分子,直接在氯离子后移动。由于凝胶孔径变小,蛋白质分子得迁移速率降低,落在后面得蛋白质便在均一得电压梯度与 pH 环境中泳动,并根据其固有得电荷与分子大小进行分离。SDS-page 电泳小问答 Q:SDSPAGE 电泳得基
7、本原理？A:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,就是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),SDS 能断裂分子内与分子间氢键,破坏蛋白质得二级与三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间得二硫键断裂,蛋白质在一定浓度得含有强还原剂得 SDS 溶液中,与 SDS 分子按比例结合,形成带负电荷得 SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量得 SDS,使蛋白质丧失了原有得电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征得负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然得电荷差异,由于 SDS 与蛋白质得结合就是按重量成比例得,因此在进行电泳时,蛋白质分子得迁移速度取决于分子大小。当分子量在 15KD 到 200
8、KD之间时,蛋白质得迁移率与分子量得对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW 为分子量,X 为迁移率,k、b 均为常数,若将已知分子量得标准蛋白质得迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它得电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。Q:配胶缓冲液系统对电泳得影响？A:在 SDSPAGE 不连续电泳中,制胶缓冲液使用得就是 TrisHCL 缓冲系统,浓缩胶就是 pH6、7,分离胶 pH8、9;而电泳缓冲液使用得 Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其 pH 环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场得作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两
9、者之间形成导电性较低得区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高得电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄得区带。当样品进入分离胶后,由于胶中 pH得增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径得缩小,在电场得作用下,蛋白分子根据其固有得带电性与分子大小进行分离。所以,pH 对整个反应体系得影响就是至关重要得,实验中在排除其她因素之后仍不能很好解决问题得情况,应首要考虑该因素。Q:样品如何处理？A:根据样品分离目得不同,主要有三种处理方法:还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用得还原 SDS
10、 处理。1、还原 SDS 处理:在还原剂中加入 SDS 与 DTT(或 Beta 巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中与,形成 SDS 与蛋白相结合得分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样 Buffer,离心,沸水煮 5min,再离心加样。2、带有烷基化作用得还原 SDS 处理:碘乙酸胺得烷基化作用可以很好得并经久牢固得保护 SH 基团,得到较窄得谱带;另碘乙酸胺可捕集过量得DTT,而防止银染时得纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20得碘乙酸胺,并在室温保温 30min。3、非还原 SDS 处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用
11、 1SDS沸水中煮 3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。Q:SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分得作用？A:聚丙烯酰胺得作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固得好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;制胶缓冲液:浓缩胶选择 pH6、7,分离胶选择 pH8、9,选择 trisHCL系统,具体作用后面介绍;TEMED 与 AP:促凝作用,加速聚丙烯酰胺得凝固;十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间得氢键、取消蛋白分子内得疏水作用、去多肽折叠。Q:提高 SDS-PAGE 电泳分辨率得途径？A:1、聚丙烯酰胺
12、得充分聚合,可提高凝胶得分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天,SDS 可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用得有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同得染色方法,具体可参照郭尧君编著得蛋白质电泳技术手册P82-103。Q:“微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因？A:主要就是由于凝胶得中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚得凝胶中。处理办法:待其充分凝固再作后续实验。Q:“皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因？A:主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般就是两板之
13、间得底部间隙气泡未排除干净。处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。Q:为什么带出现拖尾现象？A:主要就是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起得。处理办法:加样前离心;选择适当得样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。Q:为什么带出现纹理现象？A:主要就是样品不溶性颗粒引起得。处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。Q:什么就是“鬼带”,如何处理？A:“鬼带”就就是在跑大分子构象复杂得蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)得一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热得过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离得蛋白质分子重新折叠
14、结合与亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同得免疫学活性,在 WB 反应中可见其能与目标条带对应得抗体作用。处理办法:在加热煮沸后,再添加适量得 DTT 或 Beta 巯基乙醇,以补充不足得还原剂;或可加适量 EDTA 来阻止还原剂得氧化。Q:为什么溴酚蓝不能起到指示作用？A:我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来得现象。主要与缓冲液与分离胶得浓度有关。处理办法:更换正确 pH 值得 Buffer;降低分离胶得浓度。Q:为什么电泳得条带很粗？A:电泳中条带很粗就是常见得事,主要就是未浓缩好得原因。处理办法:适当增加浓缩胶得长度;保证浓缩胶贮液得pH正确(6、7);适当降低电压;Q:为什么电泳电压很高而电流却很低呢？A:这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上,可电流却在 5mA以下。主要就是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a、内外槽装反;b、外槽液过少;c、电泳槽底部得绝缘体未去掉(比如倒胶用得橡胶皮)。处理办法:电泳槽正确装配即可。Q:浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？A:这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大得影响。前者主要原因就是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者就是由于在解除制胶得夹子后,板未压紧而致空气进入引起得。处理办法:按正确得操作方法操作。