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1、中药制剂的含量测定中药制剂的含量测定第一节第一节 定量测定的目的与意义定量测定的目的与意义含量测定是中药制剂质量控制的重要指标含量测定是中药制剂质量控制的重要指标测定对象：有效成分、指标成分、毒性成分测定对象：有效成分、指标成分、毒性成分目的：判定药物的优劣，保证临床用药的安目的：判定药物的优劣，保证临床用药的安全、有效全、有效 注意点：与西药含量测定的区别注意点：与西药含量测定的区别观点：指标成分观点：指标成分 有效成分有效成分 单一成分单一成分 多指标成分多指标成分/有效成分有效成分第一节第一节 定量测定样品的处理定量测定样品的处理样品处理的作用样品处理的作用充分释放被测成分充分释放被测成
2、分除杂纯化除杂纯化富集浓缩或衍生化富集浓缩或衍生化使样品形式、溶剂符合测定要求使样品形式、溶剂符合测定要求一一.样品的粉碎样品的粉碎样品粉碎的目的：样品粉碎的目的：保证所取样品均匀且有代表性保证所取样品均匀且有代表性较快且完全地提取被测成分较快且完全地提取被测成分粉碎设备：粉碎设备：粉碎机、研钵、食品处理机粉碎机、研钵、食品处理机 高速匀高速匀浆浆机或玻璃匀机或玻璃匀浆浆器。器。二二.样品的提取样品的提取冷浸法冷浸法适用：热不稳定的样品适用：热不稳定的样品方法：称取一定量样品置于带塞容器内，加入方法：称取一定量样品置于带塞容器内，加入适量溶剂（样品量的适量溶剂（样品量的10105050倍），称
3、重，浸泡倍），称重，浸泡提取，浸泡时间提取，浸泡时间12122424小时。浸泡后再称重，小时。浸泡后再称重，补足溶剂。补足溶剂。测定：部分测定法（等量法）测定：部分测定法（等量法）全部测定法（总量测定法）全部测定法（总量测定法）优点：操作简单优点：操作简单缺点：费时、费溶剂、不易提取完全缺点：费时、费溶剂、不易提取完全 回流提取法回流提取法 适用：热稳定性的成分适用：热稳定性的成分方法：以单一溶剂或混合溶剂于水浴方法：以单一溶剂或混合溶剂于水浴/电电 热套加热回流提取热套加热回流提取优点：提取效率比冷浸法高，提取时间短，优点：提取效率比冷浸法高，提取时间短，缺点：提取杂质较多缺点：提取杂质较多
4、 不宜用于热不稳定或挥发性的成分不宜用于热不稳定或挥发性的成分连续回流提取法连续回流提取法（索氏提取索氏提取）适用：热稳定性的成分适用：热稳定性的成分方法：样品置索氏提取器中，用遇热可以方法：样品置索氏提取器中，用遇热可以 挥发的溶剂进行反复提取挥发的溶剂进行反复提取优点：提取效率高，所需溶剂少优点：提取效率高，所需溶剂少 提取杂质少，操作简便提取杂质少，操作简便 缺点：受热易分解的成分不宜使用缺点：受热易分解的成分不宜使用 超声提取法超声提取法 适用：热稳定性的成分适用：热稳定性的成分方法：方法：样样品置适当容器中，加入提取溶品置适当容器中，加入提取溶剂剂，放入超声振放入超声振荡荡器中提取。
5、器中提取。优点：提取效率高，优点：提取效率高，提取速度提取速度快，操作简便快，操作简便注意：超声频率、提取时间、温度需考察注意：超声频率、提取时间、温度需考察超临界流体提取法（超临界流体提取法（SFESFE）适用：主要用于热不稳定成分或挥发性成分，适用：主要用于热不稳定成分或挥发性成分，也可热稳定性成分也可热稳定性成分 主要用于主要用于非极性、弱极性非极性、弱极性化合物，化合物，也可也可极性化合物极性化合物加入极性改性剂（甲加入极性改性剂（甲 醇、氯仿、苯），增加其溶解能力。醇、氯仿、苯），增加其溶解能力。方法：方法：超超临临界流体萃取界流体萃取仪仪 优点：优点：萃取效率高、速度快、准确度高、
6、萃取效率高、速度快、准确度高、选择选择性性较较高、高、节节省溶省溶剂剂、易于自、易于自动动化，可避免使用易燃，化，可避免使用易燃，有毒的有机溶有毒的有机溶剂剂，并并能与色能与色谱谱和光和光谱谱等等仪仪器器联联用。用。二二.样品的分离净化样品的分离净化沉淀法沉淀法 ：利用某些试剂与被测成分或杂质生成：利用某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液的精制方法沉淀，分离沉淀或保留溶液的精制方法蒸馏法蒸馏法 ：利用某些被测成分具有挥发性，采用：利用某些被测成分具有挥发性，采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定；或某些成分蒸馏法，收集馏出液进行含量测定；或某些成分经蒸馏分解成挥发性成分，利用分解产
7、物（要求经蒸馏分解成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。结构明确）进行测定。最常用：水蒸气蒸馏法最常用：水蒸气蒸馏法 适用：适用：挥发挥发油，小分子生物碱油，小分子生物碱 优化：蒸馏液中加入一定量无机盐（盐析作用），优化：蒸馏液中加入一定量无机盐（盐析作用），使挥发性成分更完全地蒸馏出来使挥发性成分更完全地蒸馏出来 液一液萃取法液一液萃取法 直接萃取法直接萃取法 ：利用被测成分与干扰成分在有机溶：利用被测成分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到分离净化的目的。分离净化的目的。萃取次数：萃取次数：实验考察（回收率
8、符合）实验考察（回收率符合）溶剂的选择溶剂的选择：根据被测组分疏水性的相对强弱：根据被测组分疏水性的相对强弱 选择极性适当的溶剂选择极性适当的溶剂 水相水相pHpH的的控制控制：弱酸性成分：弱酸性成分 pHKpHKa a-2-2 弱碱性成分弱碱性成分 pHPKpHPKa a+2+2 盐析作用盐析作用：水相用：水相用NaClNaCl饱和，提高提取率。饱和，提高提取率。2.2.离子对萃取法离子对萃取法适用适用：高度离解的有机酸、有机碱：高度离解的有机酸、有机碱 中药制剂分析主要用于生物碱（中药制剂分析主要用于生物碱（B B）离子对试剂离子对试剂：常为酸性染料（：常为酸性染料（InIn-）如：溴百里
9、酚蓝（如：溴百里酚蓝（BTBBTB）和溴甲酚绿和溴甲酚绿（BCGBCG）注意注意：水相水相pHpH值值的的控制控制 离子离子对试剂对试剂的的选择选择。色谱法色谱法最常用最常用：经典微柱色谱（固相萃取、液经典微柱色谱（固相萃取、液固萃取）固萃取）方法方法：将样品溶液加到装有合适固定相的色：将样品溶液加到装有合适固定相的色 谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去 杂质后，再洗脱被测成分进行测定。杂质后，再洗脱被测成分进行测定。或者：使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱或者：使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱 被测成分进行测定。被测成分进行测定。适用适用于于：总类总类成分的含量成
10、分的含量测测定定 进展进展：商品商品LSELSE柱作柱作为为GCGC、HPLCHPLC的的预处预处理柱理柱LSELSE常用填料常用填料：硅胶、氧化铝等：硅胶、氧化铝等：传统传统吸附吸附剂剂 不不极性吸附作用极性吸附作用 氧化氧化铝铝：用于用于生物碱、苷生物碱、苷类类等等碱性、中性成分碱性、中性成分的的 测测定，定，吸附吸附酸性成分酸性成分硅胶硅胶：适合于分离适合于分离中性或酸性化合物中性或酸性化合物，强强烈保留烈保留 碱性化合物。碱性化合物。键合相硅胶：键合相硅胶：十八十八烷烷基基键键合相硅胶（合相硅胶（C C1818，ODSODS）、C C8 8 分分离离脂溶性脂溶性杂质杂质或成分或成分苯基
11、、苯基、氰氰基基键键合相硅胶合相硅胶 分分离离水溶性水溶性杂质杂质或成分或成分 大孔树脂：大孔树脂：分分为为极性和非极性型极性和非极性型 ，D D101101最常用最常用 注意：预处理；定量时回收率注意：预处理；定量时回收率聚酰胺：聚酰胺：氢键氢键吸附吸附常用于含常用于含phphOHOH的的黄黄酮酮类成分类成分硅藻土、纤维素：硅藻土、纤维素：亲亲水型填料，分配作用水型填料，分配作用 流流动动相相：与水不混溶的有机溶与水不混溶的有机溶剂剂 洗脱洗脱：亲亲脂脂性性的成分的成分离子交换树脂：离子交换树脂：萃取萃取样样品液中可离解化合物品液中可离解化合物 除去除去样样品中的离子，防止品中的离子，防止组
12、组分分解分分解消化法消化法目的：目的：重金属检查限量较低，有机成分重金属检查限量较低，有机成分 往往会严重干扰测定，须采用合往往会严重干扰测定，须采用合 适的方法破坏这些有机物适的方法破坏这些有机物常用的破坏方法：常用的破坏方法：湿法消化，干法消化湿法消化，干法消化湿法消化湿法消化硝酸硝酸高氯酸法高氯酸法 适用于血，尿、组织等生物样品和适用于血，尿、组织等生物样品和动植物药制剂的破坏动植物药制剂的破坏有机金属药物经破坏后，得到的无机金有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈属离子一般呈高价态高价态。本法本法不能用于含氮杂环药物不能用于含氮杂环药物的破坏的破坏硝酸硝酸硫酸法硫酸法适用于大多
13、数有机物质的破坏适用于大多数有机物质的破坏破坏得到的无机金属离子均为破坏得到的无机金属离子均为高价态高价态不能用于含碱土金属有机药物不能用于含碱土金属有机药物的破坏的破坏（不适用于与硫酸形成不溶性硫酸盐不适用于与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子）的金属离子）硫酸硫酸硫酸盐法硫酸盐法 常用于含砷或锑有机药物常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏的破坏，破坏得到的无机金属离子多为得到的无机金属离子多为低价态低价态（三价三价砷或锑）。砷或锑）。样品中加入浓硫酸作氧化剂，样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫加入硫酸盐提高硫酸的沸点酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。
14、破坏能力，且防止硫酸的分解损失。其它湿法其它湿法 硝酸硝酸硫酸硫酸高氯酸法高氯酸法 硫酸硫酸氧化剂法（过氧化氢法、高锰氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾）酸钾）破坏后，金属呈高价态破坏后，金属呈高价态注意点注意点：所用仪器一般为硅玻璃或硼玻璃制成的所用仪器一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶凯氏瓶所用试剂应为优级纯所用试剂应为优级纯水应为去离子水或高纯水水应为去离子水或高纯水按相同条件进行空白试验校正按相同条件进行空白试验校正操作在通风橱内进行操作在通风橱内进行 干法消化干法消化 将有机物灼烧灰化达到分解目的将有机物灼烧灰化达到分解目的方法方法：将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或：将适量样品置于瓷坩锅、镍
15、坩锅或铂坩埚中，常加无水铂坩埚中，常加无水NaNa2 2COCO3 3或轻或轻质质MgOMgO以以助灰化。混匀后，先小火加热，使样品助灰化。混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。其灰化完全即可。适用：适用：1.湿法不易破坏完全的有机物；湿法不易破坏完全的有机物；2.某些不能用硫酸进行破坏的有机药物某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。3.不适用：含易挥发性金属（如汞、砷不适用：含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏等）有机药物的破坏注意事项：注意事项：（1）加热或灼烧时，应控制温度在）加热或灼烧时，应控制温度在420以下，
16、防止金属化合物的挥发以下，防止金属化合物的挥发（2）一定要灰化完全）一定要灰化完全（3）经本法破坏后，所得灰分往往不易）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但不要轻易弃去溶解，但不要轻易弃去第二节第二节 常用定量分析方法常用定量分析方法 药物含量测定是评价药品质量优劣的药物含量测定是评价药品质量优劣的重要手段重要手段常用测定方法：（常用测定方法：（Ch.P2000Ch.P2000收载较多）收载较多）化学分析法化学分析法 光谱法（光谱法（UVUV、FDFD）色譜法（色譜法（HPLCHPLC、GC GC、TLCSTLCS）一一.化学分析化学分析法法包括重量分析和滴定分析包括重量分析和滴定分析 适用
17、：主要用于测定制剂中适用：主要用于测定制剂中含量较高含量较高的一些的一些成分及含成分及含矿物药制剂中的无机成分矿物药制剂中的无机成分 如：总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药如：总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药特点：仪器简单，结果准确特点：仪器简单，结果准确 但有一定的局限性，灵敏度低，操作繁琐、但有一定的局限性，灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，不适宜微量成分测定耗时长，专属性不高，不适宜微量成分测定（一）重量分析法（一）重量分析法 挥发法：测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：干燥失重、水分 灰分及炽灼残渣的测定萃取法：萃取法：根据被测组分在互不相溶的两根据被测组分在
18、互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。相中溶解度的不同，达到分离的目的。适用：总皂苷、总有机酸、总生物碱适用：总皂苷、总有机酸、总生物碱如：冰硼散中冰片的含量测定如：冰硼散中冰片的含量测定 地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定、昆地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定、昆明山海棠片中总生物碱的含量测定明山海棠片中总生物碱的含量测定 甘草浸膏中甘草酸的含量测定甘草浸膏中甘草酸的含量测定 沉淀法：沉淀法：将被测组分定量转化为难溶将被测组分定量转化为难溶 化合物，测定其含量。化合物，测定其含量。适用于：制剂中纯度较高的成分。适用于：制剂中纯度较高的成分。如：西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定如：西瓜霜
19、润喉片中西瓜霜的含量测定 苦参片中苦参总碱的含量测定苦参片中苦参总碱的含量测定 复方元胡注射液总碱的测定复方元胡注射液总碱的测定（二）滴定分析法（二）滴定分析法1.1.容量分析法的适用性及特点容量分析法的适用性及特点适用：适用：常量组分的分析常量组分的分析特点：操作简便、快速，结果准确，特点：操作简便、快速，结果准确，一般相对误差一般相对误差5n5），分别测定吸光度，绘制），分别测定吸光度，绘制A-CA-C曲曲线或求出回归直线方程（线或求出回归直线方程（r0.999r0.999）。）。在相同条件下测定供试品溶液的吸在相同条件下测定供试品溶液的吸光度，求得供试品中被测成分的浓度或光度，求得供试品
20、中被测成分的浓度或含量。含量。（二）计算分光光度法（二）计算分光光度法 适用：多组分的含量测定适用：多组分的含量测定原理：吸光度具有加和性原理：吸光度具有加和性方法：方法：双波长法（等吸收点法和系数倍率法）双波长法（等吸收点法和系数倍率法）三波长法三波长法 导数光谱法导数光谱法（三）差示光谱法（三）差示光谱法基本原理基本原理 1.1.能提供一个合适的参比溶液能提供一个合适的参比溶液2.2.在两种不同的介质环境或实验条件下，被测组在两种不同的介质环境或实验条件下，被测组分有不同的特征光谱（即不同的化学结构），分有不同的特征光谱（即不同的化学结构），而赋形剂或其它共存组分的光谱不变。因而可而赋形剂
21、或其它共存组分的光谱不变。因而可消除它们的干扰。消除它们的干扰。三三.薄层扫描法薄层扫描法 薄层吸收扫描法薄层吸收扫描法适用于适用于:在可见、紫外区有吸收的物质，及在可见、紫外区有吸收的物质，及 通过色谱前或色谱后衍生成上述化通过色谱前或色谱后衍生成上述化 合物的样品组分合物的样品组分分分:反射法和透射法，薄层扫描中大多采用反射法和透射法，薄层扫描中大多采用 反射法反射法 定量依据定量依据 Kubelka-Munk理论及曲线理论及曲线 以以斑斑点点的的相相对对反反射射率率或或相相对对透透光光率率计计算算薄薄层层色色谱谱斑斑点点的的吸吸光光度度，说说明明固固定定相相的的散散射射参参数数SXSX对
22、对斑斑点点中中物物质质的的浓浓度度与与吸吸光光度度间间关关系系的的影影响响，获获得得不不同同散散射射参参数数SXSX时时斑斑点点的的A-KXA-KX理论曲线，即理论曲线，即Kubelka-MunkKubelka-Munk曲线。曲线。不符合不符合L LB B定律：薄层板存在明显的散射现象定律：薄层板存在明显的散射现象 Kubelka-MunkKubelka-Munk曲线说明了薄层色谱斑曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间呈非线性关系，点的吸光度与其浓度间呈非线性关系，解释了薄层扫描法中标准曲线的弯曲解释了薄层扫描法中标准曲线的弯曲问题，问题，2.2.薄层荧光扫描法薄层荧光扫描法适用于：本身具
23、有荧光或经过适当处理后适用于：本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定可产生荧光的物质的测定 特点：专属性强，灵敏度比吸收法高特点：专属性强，灵敏度比吸收法高1 13 3个数个数量级，但适用范围较窄。量级，但适用范围较窄。定量原理：定量原理：当溶液浓度很稀时当溶液浓度很稀时（abc0.05）F=KC高效液相色谱法高效液相色谱法高高效效液液相相色色谱谱法法是是在在经经典典的的液液相相柱柱色色谱谱法法的的基基础础上上引引入入了了气气相相色色谱谱的的理理论论和和技技术术，采采用用高高压压泵泵，高高效效固固定定相相以以及及高高灵灵敏敏度度在在线线检检测测器器发展而成的分离分析方法发展而成的分
24、离分析方法。分析方法分析方法正相分配色谱法正相分配色谱法常用于分离强极性化合物。常用于分离强极性化合物。常用极性键合相为氨基键合相（强极性）、常用极性键合相为氨基键合相（强极性）、氰基键合相（中强极性），氰基键合相（中强极性），流动相常选用低极性溶剂如烃类，加入适量流动相常选用低极性溶剂如烃类，加入适量极性溶剂如醇类等调节洗脱液。极性溶剂如醇类等调节洗脱液。梯度洗脱时，通常逐渐增大洗脱剂中极性溶梯度洗脱时，通常逐渐增大洗脱剂中极性溶剂的比例，故样品中极性小的组分先流出，剂的比例，故样品中极性小的组分先流出，极性大的组分后流出极性大的组分后流出。氰基键合相氰基键合相的分离选择性与的分离选择性与硅
25、胶硅胶相似，相似，但极性比硅胶弱。许多能在硅胶上分离但极性比硅胶弱。许多能在硅胶上分离的样品，可以在氰基键合相上完成。氰的样品，可以在氰基键合相上完成。氰基键合相对基键合相对双键异构体双键异构体有很好的分离选有很好的分离选择性。择性。氨基键合相氨基键合相是分析是分析糖类糖类最常用的固最常用的固定相，常用乙腈定相，常用乙腈-水为流动相。水为流动相。反相分配色谱法反相分配色谱法 适合于分离弱极性和中等极性的化合物。极适合于分离弱极性和中等极性的化合物。极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。性大的组分先流出，极性小的组分后流出。常用的固定相为十八烷基硅胶键合常用的固定相为十八烷基硅胶键合相相C C
26、1818(ODS)(ODS)，其次是辛基硅烷键合硅胶；其次是辛基硅烷键合硅胶；流动相采用甲醇水或乙腈水。有时也可流动相采用甲醇水或乙腈水。有时也可加入适当的酸或碱来控制流动加入适当的酸或碱来控制流动相的相的pHpH值，以值，以防止出现不对称色谱峰。防止出现不对称色谱峰。反相色谱常采用梯度洗脱，使每个组分都在反相色谱常采用梯度洗脱，使每个组分都在适宜条件下获得分离适宜条件下获得分离 离子对色谱离子对色谱（IPC）在流动相中加入溶质分子电荷相反的离子对在流动相中加入溶质分子电荷相反的离子对试剂，来分离试剂，来分离离子型或可离子化的化合物离子型或可离子化的化合物的的方法。方法。离子对色谱法分为正相离
27、子对色谱和反相离离子对色谱法分为正相离子对色谱和反相离子对色谱法，最常用的是子对色谱法，最常用的是反相离子对色谱。反相离子对色谱。它使用反相色谱中常用的固定相（它使用反相色谱中常用的固定相（ODSODS），），能能同时分离离子型化合物和中性化合物。同时分离离子型化合物和中性化合物。HPLC条件的选择条件的选择固定相选择固定相选择 一一般般的的液液相相色色谱谱适适合合的的相相对对分分子子质质量量范范围围200-2000200-2000，相相对对分分子子质质量量大大于于20002000的的则则用用空空间排阻色谱较佳。间排阻色谱较佳。样品为酸、碱化合物，则采用离子交换色谱；样品为酸、碱化合物，则采用
28、离子交换色谱；异构体采用液异构体采用液-固吸附色谱；固吸附色谱；样样品品为为脂脂肪肪族族或或芳芳香香族族，可可采采用用液液-液液分分配配色色谱或液谱或液-固吸附色谱；固吸附色谱；同同系系物物不不同同官官能能团团及及强强氢氢键键的的样样品品可可用用液液-液液分配色分配色谱。谱。正相色谱正相色谱主要用于分离极性化合物主要用于分离极性化合物，常用氢基、氰基键合固定相。常用氢基、氰基键合固定相。反相色谱反相色谱应用最为广泛，适于分析应用最为广泛，适于分析非极性和中等极性的化合物非极性和中等极性的化合物最常用的固定相是十八烷基键合固定相最常用的固定相是十八烷基键合固定相，流动相选择流动相选择 根据不同类
29、型的色谱法选择流动相根据不同类型的色谱法选择流动相正正相相分分配配色色谱谱 流流动动相相是是以以烃烃类类（如如己己烷烷、烷烷等等）为为主主，加加入入少少量量极极性性溶溶剂剂（如如氯氯仿仿、甲甲醇醇等等）改改变变流流动动相相的的极极性性和和组组成成，分分离离异异构体、极性化合物等。构体、极性化合物等。反反相相分分配配色色谱谱 流流动动相相是是以以水水为为主主，再再加加入入能能与与水水混混溶溶的的有有机机溶溶剂剂，通通过过改改变变有有机机溶溶剂剂的的组组成成，调调整整组组分分的的容容量量因因子子，改改善善分分离离效效率率，甲甲醇醇是是最最常常用用的的有有机机溶溶剂剂，其其次次是是乙乙腈腈和四氢呋喃
30、。和四氢呋喃。在在反反相相键键合合相相色色谱谱中中，用用水水-甲甲醇醇、水水-乙腈溶液为流动相，可分离极性物质。乙腈溶液为流动相，可分离极性物质。用用水水和和无无机机盐盐的的缓缓冲冲溶溶液液作作流流动动相相，可可以以分分离离易易离离解解的的物物质质，如如有有机机酸酸、有有机碱、酚类等。机碱、酚类等。离子交换色谱离子交换色谱 流动相通常是盐类的缓冲溶液。流动相通常是盐类的缓冲溶液。通通过过改改变变流流动动相相的的PHPH、缓缓冲冲溶溶液液的的类类型型、离离子子强强度度、以以及及加加入入有有机机溶溶剂剂、配配合合剂剂都都会会改改变分离选择性，提高分离效果。变分离选择性，提高分离效果。空间排阻色谱空
31、间排阻色谱 流动相的选择不是为了提流动相的选择不是为了提高色谱柱的选择性，而是为了使样品更好地高色谱柱的选择性，而是为了使样品更好地溶解，或是为了减少流动相黏度，提高柱效。溶解，或是为了减少流动相黏度，提高柱效。选用低黏度的流动相，其沸点要比柱温高选用低黏度的流动相，其沸点要比柱温高25-25-5050，且应与选用的固定相和检测器相配。，且应与选用的固定相和检测器相配。洗脱技术洗脱技术根据分离度的要求，在色谱分离过程中样品组分根据分离度的要求，在色谱分离过程中样品组分的的k k值值范围应控制在范围应控制在1-101-10之间。之间。如果样品组分较少、性质差别不大，一般采用如果样品组分较少、性质
32、差别不大，一般采用等等度洗脱度洗脱（溶剂组成在一分析周期里保持恒定）可（溶剂组成在一分析周期里保持恒定）可以使所有组以使所有组分的分的k k值都处于这个范围内。值都处于这个范围内。对于组分数目较多、性质相差较大的复杂混合物，对于组分数目较多、性质相差较大的复杂混合物，为使各组分均得到满意的分离，必须采用为使各组分均得到满意的分离，必须采用梯度洗梯度洗脱技术脱技术，即在一个分析周期中，程序控制流动相，即在一个分析周期中，程序控制流动相的组成（如溶剂的极性、离子强度的组成（如溶剂的极性、离子强度、PHPH值等）改值等）改变，使每个组分都在适宜的条件下获得分离。变，使每个组分都在适宜的条件下获得分离
33、。梯梯度度洗洗脱脱可可以以采采用用二二元元混混合合溶溶剂剂或或多多元元混混合合溶溶剂剂，即即所所谓谓二二元元梯梯度度和和多多元元梯梯度度。梯梯度度洗洗脱脱程程序序一一般般是是以以等等强强度度洗洗脱脱的的结结果果为为基基础础，通通过过实实验验加加以以确确定定的的。对对极极性性固固定定相相，梯梯度度溶溶剂剂范范围围从从正正己己烷烷到到氯氯代代烷烷；对对非非极极性性固固定定相相，一一般般采采用用水水-乙乙腈腈、水水-甲甲醇醇线线性性梯梯度。度。梯度洗脱特别适用于极性范围很宽的混合物分离。梯度洗脱特别适用于极性范围很宽的混合物分离。优点优点 缩短总分析时间，提高分离度，是使缩短总分析时间，提高分离度，
34、是使k k值相值相差差10103 310104 4的样品组分，在合理分析速度下得到适当的样品组分，在合理分析速度下得到适当分离度的唯一方法。分离度的唯一方法。改善峰形，提高峰的对称性，减少峰的区域改善峰形，提高峰的对称性，减少峰的区域宽度，使微量组分易被检出，降低最小检出量，提高宽度，使微量组分易被检出，降低最小检出量，提高检测灵敏度。检测灵敏度。检测器的选择检测器的选择针对样品的性质不同选择适合的检测器。针对样品的性质不同选择适合的检测器。紫紫外外检检测测器器 高高灵灵敏敏度度，但但只只能能用用于于有有可可见见紫紫外外吸吸收收的的化化合合物物。主主要要用用于于芳芳烃烃与与稠稠环环芳芳烃烃、芳
35、芳香香基基取取代代物物、芳芳香香氨氨基基酸酸、核核酸酸、甾甾体激素、羧基与羰基化合物等。体激素、羧基与羰基化合物等。蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 用于用于挥发性低于流动挥发性低于流动相，紫外无吸收或呈末端吸收的样品组分相，紫外无吸收或呈末端吸收的样品组分，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低。但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低。主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体类等几十类化合物。及甾体类等几十类化合物。荧荧光光检检测测器器 适适用用于于能能产产生生荧荧光光或或其其衍衍生生物物能能发发荧荧光光的的物物质质。主主要要用用于于氨氨基基酸酸、多
36、多环环芳芳烃烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。维生素、甾体化合物及酶等的检测。电电化化学学发发光光检检测测器器 对对于于电电活活性性物物质质来来说说是是一一类类较较好好的的选选择择性性检检测测器器。主主要要用用于于有有机机胺胺类类化化合物。合物。前处理前处理流动相脱气：流动相脱气：流动相在使用前必须进行脱气流动相在使用前必须进行脱气处理，目的是除去其中溶解的气体。常用处理，目的是除去其中溶解的气体。常用的脱气方法有：超声波振动脱气、抽真空脱的脱气方法有：超声波振动脱气、抽真空脱气、加热回流脱气、吹氦脱气、真空在线脱气、加热回流脱气、吹氦脱气、真空在线脱气气 。超声波振动脱气，超声波振动脱气，
37、将欲脱气的流动相置放于将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中，用超声波振荡超声波提取器中，用超声波振荡10-15min10-15min，此法的脱气简单，最常用。此法的脱气简单，最常用。过过膜膜：流流动动相相及及供供试试液液须须经经过过0.45um0.45um或或0.2um0.2um滤膜过滤滤膜过滤Van Van DeemterDeemter方程式在方程式在HPLCHPLC中的表达式为：中的表达式为：H=A+CU HPLCHPLC可可以以近近似似地地认认为为流流动动相相的的流流速速与与板板高高成成直直线线关关系系，流流速速增增大大，板板高高增增加加，色色谱谱柱柱柱效降低。柱效降低。为为了了兼兼顾顾
38、柱柱效效与与分分析析速速度度，一一般般都都尽尽可可能能地地采采用用较较低低流流速速。内内径径4.64.6mmmm柱柱，流流量量多多采采用用1 1mLmL/min/min。色谱适用性试验色谱适用性试验色谱适用性试验可以用来评价高效液相色谱色谱适用性试验可以用来评价高效液相色谱法色谱条件。法色谱条件。按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求或规定分析状态下色谱柱应达到规定的要求或规定分析状态下色谱柱的的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因最小理论板数、分离度、重复性和拖尾
39、因子子。1.1.色色谱谱柱柱的的理理论论板板数数（n n）在在选选定定的的状状态态下下，注注入入供供试试品品溶溶液液或或各各品品种种项项下下规规定定的的内内标标物物质质溶溶液液，记记录录色色谱谱图图，量量出出供供试试品品主主成成分分或或内内标标物物质质峰峰的的保保留留时时间间tRtR（以以分分钟钟或或长长度度计计）和和半半峰峰高高宽宽（W Wh h/2/2），按按n n5.545.54（t tR R/W Wh h/2/2）2 2计计算算色谱柱的理论板数。色谱柱的理论板数。如如果果测测得得的的理理论论板板数数低低于于此此样样品品规规定定的的最最小小理理论论塔塔板板数数，应应改改变变色色谱谱柱柱的
40、的某某些些条条件件（如如柱柱长长、载载体体性性能能、色色谱谱柱柱充充填填的的优优劣劣等等），使使理理论塔板数达到要求。论塔板数达到要求。2.分分离离度度 定定量量分分析析时时，要要求求定定量量峰峰与与其其他他峰峰或或内标峰之间有较好的分离度。内标峰之间有较好的分离度。分离度（分离度（R）的计算公式为：的计算公式为：R2（tR2tR1）/W1+W2 tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2为此相邻两峰的峰宽。为此相邻两峰的峰宽。分离度应大于分离度应大于1.5。3.重复性重复性 样样品品的的对对照
41、照溶溶液液，连连续续进进样样5次次，除除另另有有规规定定外外，其其峰峰面面积积测测量量值值的的相相对对标标准准偏偏差差应应不大于不大于2.0。也也可可按按照照各各样样品品校校正正因因子子测测定定项项下下，配配置置80、100、120的的对对照照溶溶液液，加加入入规规定定量量的的内内标标溶溶液液，配配成成3种种不不同同浓浓度度的的溶溶液液，分分别别进进样样3次次，计计算算平平均均校校正正因因子子，其其相相对对标准偏差也应不大于标准偏差也应不大于2.02.0。4.拖拖尾尾因因子子 为为保保证证测测量量精精度度，特特别别当当采采用用峰峰高高法法测测量量时时，应应检检查查待待测测峰峰的的拖拖尾尾因因子
42、子（T）是是否否符符合合规规定定，或或不不同同浓浓度度进进样样的的校校正正因因子子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：TW0.05h/2d1 W0.05h为为0.05峰高处的峰宽峰高处的峰宽d1为峰极大至峰前沿之间的距离。为峰极大至峰前沿之间的距离。除另有规定外，除另有规定外，T应在应在0.951.05之间之间。定量分析方法定量分析方法 液相色谱法的定量方法，液相色谱法的定量方法，常用外标法及内标法常用外标法及内标法，也，也可用内加法、校正因子法定量。可用内加法、校正因子法定量。1.1.外外标标法法 以以试试样样的的对对照照品品作作标标准准物物质质，与与
43、标标准准物物质对比求算试样含量的方法。质对比求算试样含量的方法。外外标标法法可可分分为为外外标标工工作作曲曲线线法法、外外标标一一点点法法及及外外标标二点法等，前二种方法常用。二点法等，前二种方法常用。优优点点是是不不需需要要知知道道校校正正因因子子，只只要要被被测测组组分分出出峰峰、无干扰、保留时间适宜，即可进行定量分析。无干扰、保留时间适宜，即可进行定量分析。缺点，进样量必须准确，否则定量误差大。缺点，进样量必须准确，否则定量误差大。在在HPLCHPLC中中，一一般般用用六六通通阀阀定定量量环环进进样样，进进样样量量误误差差相相对对较较小小，因因此此外外标标法法是是HPLCHPLC常常用用
44、的的定定量量分分析析方方法法之一。之一。外标工作曲线法（简称工作曲线法）外标工作曲线法（简称工作曲线法）用用试试样样的的对对照照品品，配配制制一一系系列列浓浓度度不不同同的的对对照照品品溶溶液液，准准确确进进样样，测测量量峰峰面面积积或或峰峰高高，以以对对照照品品溶溶液液的的浓浓度度或或进进样样量量为为横横坐坐标标，以以峰峰面面积积或或峰峰高高为为纵纵坐坐标标绘绘制制工工作作曲曲线线，计计算算回归方程及相关系数。回归方程及相关系数。相相同同条条件件下下，注注入入供供试试品品溶溶液液，利利用用此此曲曲线线或回归方程或回归方程A=A=a+ba+bC C(计算样品溶液的浓度）。计算样品溶液的浓度）。
45、（2 2）外标一点法）外标一点法 只只有有在在工工作作曲曲线线通通过过原原点点，即即截截距距为为零零时时，才才可可用用外外标标一一点点法法进进行行定定量量分分析析，否否则则需需用外标二点法定量。用外标二点法定量。用用一一种种浓浓度度的的对对照照品品溶溶液液对对比比，求求算算同同一一物物质质的的样样品品（色色谱谱组组分分）含含量量的的方方法法，称称为外标一点法。为外标一点法。C Ci i与与 A Ai i分别为样品中待测组分浓度和峰面积；分别为样品中待测组分浓度和峰面积；C Cs s与与A As s分别为对照品溶液浓度与峰面积。分别为对照品溶液浓度与峰面积。峰形为正常峰时，常用峰形为正常峰时，常
46、用随行外标一点法随行外标一点法即即每次测定都同时进对照品与样品，并且浓度每次测定都同时进对照品与样品，并且浓度接近，以减少因仪器不稳定带来的误差。接近，以减少因仪器不稳定带来的误差。2.2.内标内标法法将一定量的内标物加入到样品中，再经色将一定量的内标物加入到样品中，再经色谱分析，根据样品的重量和内标物重量以谱分析，根据样品的重量和内标物重量以及待测组分峰面积和内标物的峰面积，就及待测组分峰面积和内标物的峰面积，就可求出待测组分的含量。可求出待测组分的含量。内标法可分为工作曲线法、内标一点法内标法可分为工作曲线法、内标一点法（内标对比法）、内标二点法及校正因子（内标对比法）、内标二点法及校正因
47、子法。法。所用的内标物的要求同气相色谱。所用的内标物的要求同气相色谱。内标法优点：内标法优点：可抵消仪器稳定性差，进样量不够准确可抵消仪器稳定性差，进样量不够准确等原因带来的定量分析误差。等原因带来的定量分析误差。缺点：缺点：样品配置比较麻烦，不易寻找内标物。样品配置比较麻烦，不易寻找内标物。（1）工作曲线法内内标标工工作作曲曲线线法法与与外外标标法法相相同同，只只在在各各种种浓浓度度的的标标准准溶溶液液中中，加加入入相相同同量量的的内内标标物物，进进样样。分分别别测测量量组组分分i i与与内内标标物物s s的的峰峰面面积积A A（或或峰峰高高），以以其其峰峰面面积积比比A Ai i/A/AS
48、 S浓浓度度为为纵纵坐坐标标，以以对对照照品品溶溶液液的的C Ci i（标标准准）绘绘制制工工作作曲曲线线，计计算算回回归方程式归方程式C Ci i=b=b A Ai i/As +a/As +a及相关系数。及相关系数。b b：斜率斜率；a a：截距截距A Ai i：待测组分的峰面积或峰高；待测组分的峰面积或峰高；A AS S：内标物的峰面积或峰高。内标物的峰面积或峰高。（2 2）内标对比法（内标一点法）内标对比法（内标一点法）内内标标对对比比法法 不不需需知知道道校校正正因因子子又又具具有有内内标标法法的的定定量量准准确确度度与与进进样样量量无无关关的的特特点点。方方法简便实用法简便实用。在在
49、药药物物分分析析中中分分析析结结果果（含含量量）常常用用标标示示量量%表示表示m mi i为为药物对照品的量，药物对照品的量，m m是取样量是取样量,W W为平均片重（或丸重等）为平均片重（或丸重等）3.3.内标法加校正因子法内标法加校正因子法 用用此此法法需需要要已已知知校校正正因因子子，而而高高效效液液相相色色谱谱法法的的校校正正因因子子很很难难由由手手册册中中查查到到，常常需要测定。常常需要测定。测测定定校校正正因因子子需需配配制制含含有有内内标标物物的的标标准准溶溶液液，在在相相同同实实验验条条件件条条件件下下进进样样510510次次，分分别别测测定定峰峰面面积积，计计算算各各组组分分
50、的的相相对重量校正因子。对重量校正因子。m mi i与与m ms s分别为待测物与内标物的量；分别为待测物与内标物的量；A Ai i与与A As s分别为它们的峰面积。分别为它们的峰面积。自测的相对重量校正因子，只能在此实验条自测的相对重量校正因子，只能在此实验条件下使用，而无通用性，引用时需注意。件下使用，而无通用性，引用时需注意。内标法的计算公式：内标法的计算公式：CsCs为内标物的浓度，为内标物的浓度，f f 为较正因子为较正因子A Ai i、A As s分别为待测组分和内标物的峰面积分别为待测组分和内标物的峰面积。气相色譜法气相色譜法特点：高灵敏度、高选择性、高柱效、特点：高灵敏度、高