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1、第三章第三章 抗体制备抗体制备第一节第一节 免疫原的制备免疫原的制备第二节第二节 免免疫佐剂疫佐剂第三节第三节 多克隆抗体的制备及应用多克隆抗体的制备及应用第四节第四节 单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体的制备及应用第五节第五节 基因工程抗体及应用基因工程抗体及应用第一节第一节 免疫原的制备免疫原的制备免疫原：用来制备相应抗体的抗原,是制备高质量Ab的重要保证。条 件：表位的分子结构、空间构象刺激作用好；分子量尽可能大；尽可能纯（免疫纯）。一、颗粒一、颗粒性性免疫原（细胞抗免疫原（细胞抗原、细菌抗原）的制备原、细菌抗原）的制备二、二、可溶性可溶性抗原制备抗原制备三、半抗原三、半抗原 摇动摇动15
2、-20min15-20min 44可可保保存存3 3周周 取取适量适量 NSNS洗涤洗涤3 3次次2000r/min2000r/min 10min 10minNSNS稀释至稀释至 2 25%5%一、颗粒一、颗粒性性免疫原的制备免疫原的制备 绵羊红细胞的制备流程图绵羊红细胞的制备流程图组织细胞悬液的制备流程图肾、肺 剪碎、洗涤、离心 胰酶消化 单个细胞 细菌细胞抗原的制备流程图细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或液体培养或 斜面培养斜面培养 3724h3724h100100水浴水浴 2 22.5h2.5h 杀菌杀菌无菌试验无菌试验NSNS稀释成稀释成8 81010亿亿/ml/mlO O菌体抗原菌体
3、抗原免疫方法：颗粒性抗原呈乳浊状，多用静脉内免疫，较少用佐剂作皮内注射。来源来源:组织和细胞，其成分比较复杂。组织和细胞，其成分比较复杂。二、可溶性可溶性抗原制备及鉴定抗原制备及鉴定可溶性抗原可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸 1、组织细胞抗原的制备取组织 剪碎 粉碎（高速组织捣碎机 法、研磨法）上清液上清液澄清澄清所用材料必须是所用材料必须是新鲜或低温新鲜或低温保存的保存的去除包去除包膜或结膜或结缔组织缔组织脏器进行灌洗脏器进行灌洗洗去血迹洗去血迹及污物及污物NSNS内含内含0.5g0.5gL
4、NaNL NaN3 3冷浴中组织剪碎冷浴中组织剪碎装入装入捣碎机捣碎机筒内高速粉碎或筒内高速粉碎或乳钵研磨乳钵研磨制成组织匀浆液制成组织匀浆液3000r3000rmin10minmin10min取上清液取上清液去除细胞碎片去除细胞碎片及微小组织及微小组织离心离心 2、细胞可溶性抗原的制备1)1)酶处理法酶处理法2)2)反复冻融法反复冻融法3)3)超声破碎法超声破碎法4)4)表面活性剂处理表面活性剂处理 常用酶类：常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 1.1.酶处理法酶处理法 方法：方法：在一定的条件下，能消化细菌和在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞。组织细胞。特点
5、：特点：此法适用多种微生物；此法适用多种微生物；作用条件温和；作用条件温和；内含物成分不易受到破坏；内含物成分不易受到破坏；细胞壁损坏的程度可以控制。细胞壁损坏的程度可以控制。原理：原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。方法：方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然 后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织 细胞及细胞内的颗粒可被融破。细胞及细胞内的颗粒可被融破。特点：特点：此法适用于组织细胞，对微生物细此法适用于组织细胞，对微生物细
6、胞作用较差。胞作用较差。3.3.超声破碎法超声破碎法原理：原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生空化作用由于超声波发生空化作用（cavitationcavitation）使得使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。碎。超声波使用的频率从超声波使用的频率从1kHz1kHz20kHz20kHz不等，间不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。特点：特点：操作简单，重复性较好，节
7、省时间；操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。多用于微生物和组织细胞的破碎。4.4.表面活性剂处理表面活性剂处理 原理：原理：在适当的温度、在适当的温度、pHpH及低离子强度的条及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。使膜的渗透性改变或使之溶解。常用的有：常用的有：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS,(SDS,阴离子型阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等。（非离子型）、新洁尔灭等。应用：应用：破碎细菌，且作用比较温
8、和；破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。提取核酸时，常用此法破碎细胞。(二二)可溶性抗原的纯化可溶性抗原的纯化1 1、超速离心法、超速离心法2 2、选择性沉、选择性沉淀法淀法 盐析法、有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀盐析法、有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀法、核酸沉淀剂法法、核酸沉淀剂法3 3、凝胶层析法、凝胶层析法4 4、离离子交换层析法子交换层析法5 5、亲和层析法、亲和层析法差速离心差速离心（Differential Centrifugation）:用于用于分离分离大小和密度差异较大大小和密度差异较大的颗粒。的颗粒。密度梯度离心密度梯度离心（Density gradient Ce
9、ntrifugation）:常用于常用于分离沉降系数不同分离沉降系数不同的组分，不适于大量制的组分，不适于大量制备实验。备实验。等密度梯度离心等密度梯度离心（Isopycnic gradient Centrifugation）常用于常用于分离密度不同分离密度不同的组分。的组分。1 1、超速离、超速离心法心法离心方法的选择 方法方法离心特点离心特点分离效果分离效果适用范适用范围围差速离心差速离心短短时间时间、多次用不、多次用不同速度和同速度和时间时间离心。离心。粗分离，粗分离，纯纯度和效率不度和效率不高。高。分子量相差大分子量相差大、不、不稳稳定、定、易易变变性的物性的物质质。常用。常用于分离于
10、分离细细胞器和病毒。胞器和病毒。密度梯度离心密度梯度离心短短时间时间，低速度，低速度，样样品不完全沉品不完全沉降。降。效果效果较较好，可分出好，可分出较纯较纯颗颗粒。粒。大小不同而密度相似大小不同而密度相似的的物物质质。可分离核酸、。可分离核酸、蛋白蛋白质质、核糖体、核糖体亚亚基基和脂蛋白等。和脂蛋白等。等密度离心等密度离心长时间长时间，高速度，高速度，样样品完全沉降品完全沉降到平衡位置。到平衡位置。效果效果较较好，可分出好，可分出较纯较纯颗颗粒。粒。大小相同而密度不同大小相同而密度不同的的物物质质。可分离复合蛋。可分离复合蛋白白质质、核酸、核酸、亚细亚细胞胞器等。器等。盐析法：盐析法：在大量
11、制备中先用此法粗提，再纯在大量制备中先用此法粗提，再纯化。化。有机溶剂沉淀法；有机溶剂沉淀法；蛋白质和核酸的提纯。蛋白质和核酸的提纯。蛋白质蛋白质通常采用乙醇或丙酮进行沉淀，通常采用乙醇或丙酮进行沉淀，DNA和和RNA可用乙醇或可用乙醇或2-乙氧基乙醇进行沉淀。乙氧基乙醇进行沉淀。非离子聚合物沉淀法非离子聚合物沉淀法：应用于蛋白质、核酸、应用于蛋白质、核酸、酶、细菌和病毒的分离纯化。酶、细菌和病毒的分离纯化。2 2、选择性沉、选择性沉淀法淀法原理：原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种经适当溶液平衡后，装入层析柱。
12、当含有各种 分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分大分 子物质子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时短时 间内被洗脱出来间内被洗脱出来；而；而分子较小分子较小的物质则进入凝的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢洗脱较慢。分。分 成大、中、小三种类型。成大、中、小三种类型。3 3、凝胶层析法、凝胶层析法图图3-5 凝胶层析原理示意图凝胶层析原理示意图A小分子进入凝胶颗粒内部被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外
13、面；小分子进入凝胶颗粒内部被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面；B（1）样品溶液上柱；（）样品溶液上柱；（2）样品溶液流经层析柱；（）样品溶液流经层析柱；（3）小分子被）小分子被滞留，大分子向下移动；（滞留，大分子向下移动；（4）大小分子完全分开；（）大小分子完全分开；（5）大分子）大分子流出层析柱，小分子尚在柱中。流出层析柱，小分子尚在柱中。原理：原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。所带电荷不同，与纤维素结合的能力
14、有差别。当梯度当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的置，从而使血清中的蛋白质分成蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白球蛋白和清蛋白等几等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。4 4、离离子交换层析法子交换层析法图图3-4 离子交换层析原理示意图离子交换层析原理示意图1.平衡阶段：离子交换剂与平衡离子结合；平衡阶段：离子交换剂与平衡离子结合；2.交换阶段：样品与平衡离子交换；交换阶段：样品与平衡离子
15、交换；3.阶段洗脱：缓冲液洗脱，结合力弱的分子洗脱下来；阶段洗脱：缓冲液洗脱，结合力弱的分子洗脱下来；4.终末洗脱：结合力强的分子洗脱下来；终末洗脱：结合力强的分子洗脱下来；5.再生阶段：再生阶段：酸或碱处理，再用洗脱液平衡，即可恢复初始状态。酸或碱处理，再用洗脱液平衡，即可恢复初始状态。原理：原理：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。优点：优点：提取纯度
16、高、抗原抗体不失活性。酶与底物、受体与配体、酶与底物、受体与配体、抗体抗体与与抗原抗原5 5、亲和层析法、亲和层析法正常细胞正常细胞 标记细胞标记细胞洗涤洗涤标记细胞标记细胞被酶裂解被酶裂解加入特异加入特异性抗体性抗体其它蛋白其它蛋白洗涤流失洗涤流失SDS-PAGESDS-PAGE分离蛋白分离蛋白 亲和层析法示意图亲和层析法示意图分离纯化方法的比较 方法方法原理原理优优点点缺点缺点应应用用离心分离法离心分离法离心力和物离心力和物质质沉降系数沉降系数的差的差别别操作操作简单简单分辨率低分辨率低蛋白蛋白质质分离分离盐盐析法析法盐盐析作用析作用操作操作简单简单，成本低，成本低，重复性重复性较较好好分
17、辨率低，分辨率低，纯纯化化倍数低倍数低蛋白蛋白质质的分的分级级沉淀沉淀有机溶有机溶剂剂沉淀沉淀法法脱水作用和降脱水作用和降低介低介电电常常数数操作操作简单简单，分辨力，分辨力较较强强 对对蛋白蛋白质质有有变变性性作用，成本作用，成本较较高高蛋白蛋白质质、多、多肽肽、核、核酸和多糖的分酸和多糖的分级级沉淀沉淀凝胶凝胶层层析法析法分子分子筛筛的排阻的排阻作用作用分辨力分辨力强强，不引起蛋，不引起蛋白白质变质变性性成本高成本高分子分子质质量有差量有差别别的的可溶性物可溶性物质质离子交离子交换换法法离子基离子基团团的交的交换换作用作用分辨力分辨力强强，分离量大，分离量大费时间费时间，酸碱用，酸碱用量大
18、量大可可电电离的生化物离的生化物质质亲亲和和层层析法析法分离物与配体分离物与配体间间的的亲亲和和作用作用分辨力很分辨力很强强一种配体只分离一种配体只分离一一类类物物质质，局限性大局限性大生命大分子物生命大分子物质质 二、可溶性可溶性抗原制备及鉴定抗原制备及鉴定温和条件解离可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋白亚单位分开。二硫键解离氧化法和还原法是将免疫球蛋白轻、重链分开的两种常用方法。溴化氰裂解法酶裂解法酶对免疫球蛋白的水解有极好的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解为不同的片段。(三三)免疫球蛋白片段的制备免疫球蛋白片段的制备 酶水解免疫球蛋白示意图酶水解免疫球蛋白示意图FcFc段，用段，用以
19、制备抗以制备抗重链血清重链血清F(ab)F(ab)2 2，常作为常作为抗体试剂抗体试剂用于试验用于试验木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶（papainpapain)胰蛋白酶胰蛋白酶(pepsin)(pepsin)胃蛋白酶胃蛋白酶(pepsin)(pepsin)1.1.半抗原：半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。包括抗生素）及其他化学物品等。2.2.载体：载体：蛋白质类蛋白质类 多肽聚合物多肽聚合物 大分子聚合物大分子聚合物3.3.半抗原半抗原-载体连接方
20、法载体连接方法:三、半抗原 载体类型载体类型 1.1.蛋白质：蛋白质：人血清白蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白牛血清白蛋白、兔、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。2.2.多肽聚合物：多肽聚合物：人工合成的，常见的有人工合成的，常见的有多聚赖多聚赖 氨酸氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万，其分子量大（可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。物产生高效价、高亲和力的抗体。3.3.大聚合物：大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加
21、入弗氏完全佐剂亦等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。可诱发动物产生抗体。半抗原半抗原-载体连接方法载体连接方法1 1碳化二亚胺法：碳化二亚胺法：戊二醛法戊二醛法:氯甲酸异丁脂法：氯甲酸异丁脂法：琥珀酸酐法：琥珀酸酐法：二、可溶性可溶性抗原制备及鉴定抗原制备及鉴定纯化抗原的浓缩吸附浓缩:通过吸附剂吸收溶液中的溶剂分子以达到浓缩目的的方法。常用的吸附剂有聚乙二醇（PEG）、凝胶、蔗糖等。蒸发浓缩超浓缩:采用具特定孔径的滤膜，通过滤膜对溶液中不同溶质分子进行选择性过滤的方法。尤其适合用于蛋白质和酶的浓缩及脱盐，具有成本低、操作方便、能较好保持大分子物质生物学活性及回收率高的优
22、点。纯化抗原的保存：置低温保存。1.1.含量鉴定含量鉴定 2.2.理化性质鉴定理化性质鉴定 凝胶层析技术测定凝胶层析技术测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳凝胶管状电泳 超速离心超速离心3.3.纯度鉴定纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳常用醋酸纤维膜电泳 4.4.免疫活性鉴定免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验常用双向琼脂扩散试验第二节第二节 免疫佐剂（免疫佐剂（adjuvant）1、概念概念 预先或与抗原同时注入机体，可增预先或与抗原同时注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的答类型的非特异性免疫增强性物质。非特异性免疫增强性物质
23、。2、种类、种类 生物性：生物性：BCGBCG、CPCP、LPSLPS 人工合成：人工合成：poly I:Cpoly I:C、poly A:Upoly A:U 弗氏佐剂与弗氏不完全佐剂：动物实验弗氏佐剂与弗氏不完全佐剂：动物实验 最常用最常用 无机物：氢氧化铝、明矾无机物：氢氧化铝、明矾颗粒性抗原颗粒性抗原:一般不使用佐剂一般不使用佐剂可溶性抗原可溶性抗原:初次免疫初次免疫使用佐剂使用佐剂完全弗氏佐剂完全弗氏佐剂:不宜不宜连续使用连续使用两次两次佐剂的使用原则 3、应用：、应用：预防接种；预防接种；抗肿瘤和慢性感染。抗肿瘤和慢性感染。第三节第三节 多克隆抗体的多克隆抗体的制备及应用制备及应用克
24、隆克隆（clone）：由单一细胞增殖形成的细胞群体，称为细胞克隆。多克隆抗体多克隆抗体（polyclonal antibody）:由于天然抗原分子中常含有多种不同抗原特异性的抗原决定簇，刺激机体免疫系统，可使体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对多种抗原决定族的免疫球蛋白，获得的抗血清是含多种抗体的混合物，因而称多克隆抗体，也称为第一代抗体。抗血清的条件：尽量选用特异性强、效价高、亲和力高。抗血清的分类按用途：诊断血清、治疗血清、预防血清。按成分：单价血清、多价血清。能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。1.抗原与免疫动物的种系关系:亲缘关系越远越好；2.动物的
25、机体状态：选适龄、健壮、无感染的正常动物、雄性,体重合乎要求；3.按需要量选择大小不同的动物:量大用羊、马；量小用豚鼠、家兔；一、一、免疫动物的免疫动物的选择选择 4.按抗血清性质的要求选择动物：R型抗血清：兔；H型抗血清：马(极少用于沉淀反应)。5.抗原的要求：不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；n蛋白质免疫-大多数动物皆适合，常用羊、兔;n胰岛素免疫-选用豚鼠等进行；n甾体激素类免疫-多用家兔；n酶类免疫-多用豚鼠。二、免疫方法 3.一般而言，小鼠首次免疫剂量为50-400g/次，大鼠0.1-1mg/次，兔0.2-1mg/次，加强免疫剂量为首剂量的1/5-2/5。1.剂量过低，不能形
26、成足够强的免疫刺激，剂量过高，可导致免疫耐受，合适的剂量则可诱导抗体的产生。2.在一定的剂量范围内，抗原量越大，免疫效果越好。抗原用量一般按体重计算:小动物：0.1-0.6mg/只；大动物：0.5-1.0mg/只；半抗原应用同一载体。4.如需制备高特异性抗血清，可选择低剂量短程免疫法，而要获得高效价抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。二、二、免疫剂量的免疫剂量的选择选择 1.免疫间隔:首次与二次免疫一般间隔10-20d为宜;三次免疫以后间隔7-10d为宜.免疫的总次数多为5-8次.2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为:静脉 腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌 3.不同抗原可采用不用的免疫途径：颗粒性抗原：
27、多用静脉注射可溶性抗原：多用皮内;皮下;淋巴结;足掌多点注射半抗原：多用皮内多点注射三、三、免疫免疫时间和途径的选择时间和途径的选择 三、动物采血法三、动物采血法四、采血方法四、采血方法 1.1.采血时间采血时间：动物免疫动物免疫-次后，抗体效价经检测合格次后，抗体效价经检测合格后，可采血。后，可采血。一般在末次免疫一般在末次免疫5-75-7天天，采血前动物应禁，采血前动物应禁食食24h24h。2.2.采血原则采血原则：无气泡、不溶血、无菌操作：无气泡、不溶血、无菌操作.三、动物采血法三、动物采血法3.3.采血方式采血方式：颈动脉放血法颈动脉放血法：最常用：最常用心脏采血法心脏采血法：家兔一次
28、可采：家兔一次可采20-20-30ml30ml,要求操作熟练要求操作熟练静脉多次采血法静脉多次采血法：采集血液量最多：采集血液量最多.4.4.抗血清的分离抗血清的分离 自然条件下凝固自然条件下凝固置置3737或或44使血块收缩使血块收缩：3737时：快、血清较少；时：快、血清较少；44时：时间较长，可能溶血，但析出的时：时间较长，可能溶血，但析出的 血清多，效价稳定。血清多，效价稳定。分离血清分离血清2000r/min,2000r/min,离心离心10min.10min.56 30min56 30min，灭活补体灭活补体。1.1.抗体效价抗体效价(含量含量)的鉴定：的鉴定：凝集、双扩、放免凝集
29、、双扩、放免 2.2.抗体特异性鉴定：抗体特异性鉴定：细菌类抗原的抗体细菌类抗原的抗体用用凝集试验凝集试验 可溶性抗原的抗体可溶性抗原的抗体用用双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验 3.3.抗体的纯度鉴定：抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法免疫电泳分析法(SDS-PAGE)4.4.抗体亲和力鉴定：抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好亲和力高则灵敏度好(放免放免)五、五、抗血清的鉴定和保存抗血清的鉴定和保存1.1.44保存保存：加加NaN3(NaN3(叠氮钠叠氮钠),),可保存可保存3 36 6个月个月2.2.低温保存低温保存：分装分装,-20-20-40-40，可保存，可保存5 5年年3.3.冷冻干燥保
30、存冷冻干燥保存：可保存可保存5 51010年年抗血清的保存抗血清的保存六、抗体的六、抗体的纯化纯化IgGIgG类抗体的纯化类抗体的纯化1.1.盐吸沉淀法：盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取经硫酸铵盐吸提取球蛋白球蛋白 3 3次，基本为次，基本为IgGIgG类类抗体，但不纯。抗体，但不纯。2.A2.A蛋白亲和层析：蛋白亲和层析：SPASPA与与IgGIgG的的FcFc段有很强的段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个与抗体结合，一个A A蛋白至少可以结合二个蛋白至少可以结合二个 IgGIgG分子。适合纯化细胞培养上清中的分子。适合纯化细
31、胞培养上清中的McAbMcAb。3.3.其它：其它：凝胶过滤、离子交换层析等凝胶过滤、离子交换层析等 一、抗体特异性的纯化一、抗体特异性的纯化 1.1.亲合层析法：亲合层析法：将交叉抗原交联到将交叉抗原交联到SepharoseSepharose 4B 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。性抗体。2.2.吸附法：吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂
32、抗体的清液则为无杂抗体的单价特异性抗体单价特异性抗体。特异性抗体的纯化特异性抗体的纯化多克隆抗体的实际意义多克隆抗体的实际意义：预防、治疗感染性疾病预防、治疗感染性疾病(人工被动免疫人工被动免疫)如：破伤风抗毒素血清如：破伤风抗毒素血清 抗抗破伤风破伤风 副作用：副作用：超敏反应超敏反应临床诊断临床诊断(免疫学检测免疫学检测):):如：肥达氏反应如：肥达氏反应 -伤寒、副伤寒，伤寒、副伤寒，抗血清的优点抗血清的优点:来源广泛（来源于动物或人）来源广泛（来源于动物或人）,制备容易。制备容易。抗血清的缺点抗血清的缺点:特异性不高特异性不高,容易发生交叉反应容易发生交叉反应产量有限，重现性差产量有限
33、，重现性差免疫原性弱的抗原，很难产生抗体免疫原性弱的抗原，很难产生抗体质量控制难质量控制难 第四节第四节 单克隆抗体单克隆抗体的制备及应用的制备及应用单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)：由一个B细胞杂交瘤细胞克隆产生的只识别抗原分子上一种抗原决定簇的抗体分子。也称为第二代抗体。特点：特点：具有高度均一性(同种型、抗原结合部位、独特型都相同)生物活性专一,特异性强，纯度高。体外可大量制备，亲和力强。一、杂交瘤技术的基本原理 1.杂交瘤细胞:2个细胞杂交,有1个细胞是瘤细胞，则融合的细胞称为杂交瘤细胞。亲本细胞:小鼠-小鼠;大鼠-大鼠;小鼠-人;人-人。该细胞
34、具有两种亲本细胞的基因和特性,是一种特殊的杂种细胞系。2.B杂交瘤细胞：体外增殖,分泌McAb。骨髓瘤细胞-无限增殖；免疫B细胞-合成、分泌特异性抗体。3.杂交瘤技术制备McAb所依据的三个原则淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体。细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可保持双方亲代细胞的特性。利用代谢缺陷补救机理，可筛选出杂交瘤细胞。二、杂交瘤细胞的制备过程亲本细胞的选择与融合杂交瘤细胞的形成杂交瘤细胞的筛选HAT选择培养基1、亲本细胞的选择与融合（1）融合细胞的选择被高纯度免疫原刺激的Balb/c株小鼠脾细胞：能产生抗体，体外不能培养。同一品系小鼠的骨髓瘤细胞：不能产生抗体，体外
35、可人工培养。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)缺陷型筛选方法：反复腹腔注射降植烷等(油类制剂)Balb/c株小鼠 适宜培养条件小鼠骨髓瘤细胞无限繁殖，分泌某种Ig筛选原则：1.骨髓瘤细胞最好本身不产生Ig(如：小鼠骨髓瘤P3、653和Sp2/0 细胞株)。2.选育出缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)的细胞株 HGPRT 缺陷株。附：小鼠骨髓瘤细胞的筛选HGRPT 缺陷株的选育方法：1.通常采用毒性药物-AG(氮鸟嘌呤)，选育出HGRPT 缺陷株。2.利用BudR(溴脱氧尿嘧啶)诱发缺乏胸腺嘧啶核苷激酶(T)的突变细胞株，以选HGRPT细胞株。注：在多次传代培养过程中，有个别小鼠骨
36、髓瘤 细胞可能出现返祖现象，故应定期用-AG 处理细胞。（2）用细胞融合剂使两类细胞融合(杂交)最常用的为聚乙二醇PEG。分子量1000固态；对细胞有毒性，毒性随分子量的增加而加重。实验一般选1000、1500、2000，应用浓度为40%（W/V）。融合细胞的机理不明。细胞融合骨髓瘤细胞 PEG脾细胞融合后细胞的类型:未融合的脾细胞 杂交瘤细胞 未融合的瘤细胞杂交瘤细胞2、选择培养杂交瘤细胞(HAT选择培养基)(1)HAT培养基的成分：常用细胞培养基。次黄嘌呤(H，核苷酸的前体),氨基蝶呤(A，叶酸拮抗物，阻断DNA合成)胸腺嘧啶核苷(T)。合成DNA两条途径：主途径：糖+AA(需辅酶叶酸参与
37、)核苷DNA次途径：H+T DNAHGPRTHGPRTTKTK（2)融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞(HGPRT+,TK+)不能长期生长，5-7天死亡骨髓瘤细胞(HGPRT-,TK-)合成DNA被氨基蝶呤(A)阻断，又缺乏HGPRT，不能利用次黄嘌呤(H)合成DNA而死亡不能生长杂交瘤细胞(HGPRT+,TK+)能够生长细胞的多聚体：容易死去。抗原抗原(多表位多表位)免疫小鼠免疫小鼠 骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞培养 免疫脾细胞免疫脾细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 PEGPEG 细胞融合细胞融合 HATHAT培养基培养基 杂交瘤细胞的筛选与克隆化杂交瘤细胞的筛选与克隆化 McAbMcAb的大量
38、制备的大量制备单克隆抗体的制备程序B杂交瘤细胞的制备亲本细胞的选择与融合杂交瘤细胞的筛选(HAT选择培养基)阳性克隆的筛选和克隆化单克隆抗体的制备单克隆抗体的纯化抗原特异性杂交瘤细胞的筛选筛选：目的：筛选出能分泌特异性Ab的杂交瘤细胞(阳性细胞)。方法：免疫荧光、ELISA等检测培养液中的特异性Ab。克隆化：采用有限稀释法充分稀释0几个细胞 培养(30%的孔为0才能保证每个孔中为单一细胞)上清，ELISA检测特异性Ab。再克隆化：上述阳性细胞株再克隆化，ELISA重复检测，大量增殖，保存，体外培养或腹腔注射。有限稀释法操作示意图 三、单克隆抗体的生产大量制备单克隆抗体的方法：体内诱生法：杂交瘤
39、细胞接种于小鼠腹腔中,取腹腔液，离心取上清液。体外培养法:用于实验室制备少量McAb；杂交瘤细胞细胞培养上清液中分离McAb。四、单克隆抗体的纯化对于日常诊断或定性研究，无需提纯。如用于交联荧光素、酶、同位素或生物素等，必须进一步分离和提纯。纯化的方法：过滤、离心去除大颗粒物，再用盐析、凝胶过滤、离子交换层析等纯化，常用亲和层析法。五、单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的鉴定定性：抗原特异性、g类型、决定簇、亲和性等。定量：效价。杂交瘤细胞的冻存和复苏冻存：采用液氮(-196)保存，常以小牛血清或RPMI-1640培养液配成最终浓度10的二甲亚砜(DMSO)为冻存液，-“慢冻慢冻”。复苏：冷冻管立即浸
40、入3740水浴中“快融快融”，将细胞移入培养液中洗涤（去DMSO），离心。四、单克隆抗体在医学上的应用（1）临床检验诊断试剂；（2）蛋白质的纯化；（3）肿瘤的导向治疗；（4）放射免疫显像技术单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题1.单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应。2.异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应。第五节基因工程抗体及应用概念(genetic engineering antibody)：又称重组抗体，指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分
41、子，也称为第三代抗体。种类：主要包括人源化抗体、小分子抗体、双特异性抗体、抗体融合蛋白等。一.人源化抗体（humanized antibody）1、人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody)从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。特点：减少了鼠源性抗 体的免疫原性，同时保留了亲本 抗体特异性结合 抗原的能力。2、CDR植入抗体将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在 小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术,产 生大量完全人源化 抗体。二.小分子抗
42、体 指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。抗原结合片段、可变区片段、单链抗体、重链抗体 特点：能保持与抗原结合 的性能，分子量小，穿透 性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。小分子抗体的应用：1.用于肿瘤的导向治疗2.肿瘤的影像分布3.基因治疗 细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物的抗体，可干扰该基因产物的生物活性。4.研究基因结构与功能的关系三、双价抗体与双特异性抗体三、双价抗体与双特异性抗体 (bispecificbispecific antibody)antibody)双特异性抗体是将一种抗体分子与另一种功能分子如毒双特异性抗体是将一种抗体分子与另一种功能分子如毒素、酶或另一
43、种抗体分子结合形成具有双重功能的抗体素、酶或另一种抗体分子结合形成具有双重功能的抗体,又称又称双功能抗体双功能抗体。许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别将识别肿瘤抗原的抗体肿瘤抗原的抗体和和 识别识别细胞毒性免疫效应细胞细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。四、抗体融合蛋白五、噬菌体抗体库技术六、重组多克隆抗体