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1、1、为什么要固定化酶？、为什么要固定化酶？传统酶（自由酶）催化反应存在如下缺点：传统酶催化反应几乎都在水溶液中进行，只能一次只能一次性使用，难以回收性使用，难以回收；酶与产物混合，增加产物分离和纯化难度产物分离和纯化难度；溶液中酶的稳定性差稳定性差，容易失活。而将酶固定化能够克服这些缺点。该项技术于20世纪60年代发展起来的，1971年第一届国际酶工程会议正式建议采用固定化酶的名称。第1页/共29页2、固定化酶的优点、固定化酶的优点可以重复使用重复使用，在大多数情况下，稳定性明显提高稳定性明显提高；催化后，酶与底物容易分开，产物易于分离纯化产物易于分离纯化；反应条件易于控制反应条件易于控制，可
2、实现反应的连续化和自动控制；酶的利用效率高酶的利用效率高；更适合于多酶催化多酶催化反应。第2页/共29页3、固定化酶的缺点、固定化酶的缺点存在着酶失活酶失活现象；消耗固定化材料，增加成本增加成本；增加底物和产物的传质阻力传质阻力。以此，考虑固定化酶的优缺点，在工业采用固定化还是液态的，应该根据具体情况分析而定。第3页/共29页4、固定化酶的主要方法、固定化酶的主要方法（1）载体结合法：将水不溶性的载体与酶结合。物理吸附法：使酶直接吸附在载体上的方法。常用的载体：a有机载体,如面筋、淀粉等；b无机载体,如活性炭、氧化铝、高岭土、多孔玻璃、硅胶等氧化铝活性碳多孔玻璃第4页/共29页离子吸附法：将酶
3、与含有离子交换基团的水不溶性载体结 合。此法在工业上应用较广泛,常用的载体有:a阴离子交换剂,如二乙氨基乙基(DEAE)纤维素等;b阳离子交换剂,如羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐等。第5页/共29页（2）共价偶联法：将不溶性载体与酶蛋白以共价键形式结合成固定化酶的方法，包括重氮法、肽键法和烷化法等。第6页/共29页（3）包埋法：将游离酶包埋于格子或微胶囊内，格子的结 构可以防止酶渗出到周围的培养基中，而底物分子仍 能渗入格子内与酶接触。第7页/共29页包埋法中具体的一些包埋方法包埋法中具体的一些包埋方法聚乙二醇聚乙二醇（PEG）第8页/共29页（4）交联法：利用双功能或多功能试剂,使酶分
4、子之间或酶蛋白与其它惰性蛋白之间发生交联,凝聚成网状结构,对酶行固定。戊二醛是应用最广泛的双功能试剂。中文名称：戊二醛（中文名称：戊二醛（1，5-戊二醛）戊二醛）第9页/共29页（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶交联与共价偶联不要混淆！交联与共价偶联不要混淆！第10页/共29页第11页/共29页DEAECellulose固定化过氧化氢酶DEAE-SephadexA-50固定化氨基酰化酶胶格包埋法固定化胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶戊二醛交联固定化羧肽酶固定化酶的应用（1）-酶法生产第12页/共29页固定
5、化酶的应用（固定化酶的应用（2）-多酶催化多酶催化FDHFADHADHCO2HCOOHHCHOCH3OHNADHNADHNADH甲酸脱氢酶（FDH）、甲醛脱氢酶（FADH）和乙醇脱氢酶（ADH）三种脱氢酶作为催化剂，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作为电子供体，考察了酶法转化CO2为甲醇的可行性。包埋法固定化包埋法固定化3个酶的混合物。个酶的混合物。第13页/共29页固定化酶的应用固定化酶的应用-酶传感器酶传感器固定化酶膜可以选择性地“识别”被检测的物质，并且催化被“识别”出的物质发生化学反应；变换器则把这一催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，进而通过仪表显示出来。第14页/共29
6、页血糖-乳酸分析仪 测定对象为葡萄糖和L-乳酸，固定化酶膜采用葡萄糖氧化酶和L-乳酸氧化酶经戊二醛固定化制成。固定化酶膜的保存期达1年，使用寿命乳酸膜为15天以上，葡萄糖膜为30天以上。尿糖试纸尿糖试纸，水质检测。，水质检测。第15页/共29页四、四、有机介质中的酶反应有机介质中的酶反应有利于疏水性疏水性底物的反应；能催化在水中不能进行的反应；可防止由水引起的副反应；酶和产物易于回收易于回收；可避免微生物污染避免微生物污染。第16页/共29页1、有机介质中酶促反应的条件、有机介质中酶促反应的条件必需水必需水酶的选择溶剂及反应体系的选择pH选择和离子强度的影响 第17页/共29页必需水：紧紧吸附
7、在酶分子表面，维持酶催化活性所必需 的最少量水，与溶剂中的水含量没有关系与溶剂中的水含量没有关系。a不同酶需水量不同b.同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同溶剂疏水性越强，需水量越少疏水性越强，需水量越少第18页/共29页山梨醇改变水活度改变底物的离子化程度头孢氨苄合成中助溶剂的影响第19页/共29页 酶的选择：酶的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶等。脂肪酶：即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有
8、重要意义。蛋白酶：催化蛋白质水解的酶类。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物。第20页/共29页有机介质中酶催化的应用有机介质中酶催化的应用 酶酶 催化反应催化反应 应用应用 脂肪酶 肽合成 青霉素G前体肽合成 酯合成 醇与有机酸合成酯类 转酯 各类酯类生产 聚合 二酯的选择性聚合 酰基化 甘醇的酰基化 蛋白酶 肽合成 合成多肽 酰基化 糖类酰基化 羟基化酶 氧化 甾体转化过氧化物酶 聚合酚类、胺类化合物的聚合胆固醇氧化酶 氧化 胆固醇测定 醇脱氢酶 酯化 有机硅醇的酯化第21
9、页/共29页溶剂的选择溶剂的选择：水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙腈等水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等第22页/共29页有机溶剂的选择有机溶剂的选择酶酶合成产物合成产物有机溶剂有机溶剂使用浓度使用浓度（%）合成收率合成收率（%）枯草杆菌蛋白酶核糖核酸酶甘油9050无色杆菌蛋白酶人胰岛素DMF和乙醇3080羧肽酶牛胰核糖核酸酶甘油9050凝血酶人生长激素甘油8020嗜热杆菌蛋白酶天冬甜味素乙酸乙酯6035胰凝乳蛋白酶脑啡肽乙醇或DMF6530第23页/共29页pH选择和离子强度的影响 酶在水相的pH值可在有机相中保持，同一种酶不同来
10、源，对pH值敏感程度大不相同。第24页/共29页 有机介质中酶反应应用（有机介质中酶反应应用（1）-手性化合物的拆分手性化合物的拆分手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物。一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效 一种有显著疗效，另一种有毒副作用 两种对映体的药效相反 两种对映体具有各自不同的药效 两种消旋体的作用具有互补性手性药物的拆分已经成为最热门、手性药物的拆分已经成为最热门、最具发展性的酶学研究应用领域。最具发展性的酶学研究应用领域。第25页/共29页核心：利用酶的对映体选择性进行光学异构体的合成与拆分。青霉素酰化酶青霉素酰化酶催化叔亮氨酸拆分青霉素酰化酶催
11、化叔亮氨酸拆分第26页/共29页有机介质中酶反应应用（2）-生物柴油生产生物柴油的两大方法：化学法：采用生物油脂与甲醇或乙醇等低碳醇，并使用氢氧化钠(占油脂重量的1%)或甲醇钠做为触媒，在酸性或者碱性催化剂和高温（230250）下发生酯交换反应生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，再经洗涤干燥即得生物柴油。酶法：即用动物油脂和低碳醇通过脂肪酶脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯。酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、无污染排放的优点。2001年日本采用固定化霉菌Rhizopusoryzae细胞生产生物柴油，转化率在80左右，微生物细胞可连续使用430小时。第27页/共29页第28页/共29页感谢您的观看！第29页/共29页