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1、中英联合实验室13.1 3.1 蛋白蛋白质样品制品制备第1页/共81页中英联合实验室2目前，二目前，二维聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳依然泳依然是大多数蛋白是大多数蛋白质组研究中复研究中复杂蛋白混蛋白混合物的核心技合物的核心技术。而。而选择合适的合适的样品品制制备方法方法对获得得满意的二意的二维电泳泳图谱是十分重要的。是十分重要的。对不同不同类型的蛋白型的蛋白进行行样品制品制备时，需要采用不同的方法和条件。溶解的需要采用不同的方法和条件。溶解的效果依靠效果依靠选择的的细胞破碎方法、蛋白胞破碎方法、蛋白解聚和溶解方法、去解聚和溶解方法、去污剂和裂解液成和裂解液成分等来分等来实现。第2页/共81页中
2、英联合实验室3样品制品制备的原的原则1.1.尽可能采用尽可能采用简单方法，以避免蛋白方法，以避免蛋白丢失；失；2.2.细胞和胞和组织样品的制品的制备应尽可能减少蛋白尽可能减少蛋白质的降的降 解，低温和蛋白解，低温和蛋白酶抑制抑制剂可防止蛋白可防止蛋白质的降解；的降解；3.3.样品裂解液品裂解液应新新鲜制制备，并分装存于，并分装存于-80-80。勿反。勿反 复复冻融已制融已制备好的好的样品；品；4.4.通通过超速离心清除所有的超速离心清除所有的杂质；5.5.加入尿素之后加温不要超加入尿素之后加温不要超过3737，防止氨甲，防止氨甲酰化化 而修而修饰蛋白。蛋白。第3页/共81页中英联合实验室4 温
3、和的裂解方法温和的裂解方法 用于用于组成比成比较简单的的样品，或分析某一特品，或分析某一特定的定的细胞器。胞器。常用方法：常用方法：（1 1）渗透裂解：血）渗透裂解：血细胞、胞、组织培养培养细胞胞（2 2）冻融裂解：融裂解：细菌、菌、组织培养培养细胞；液氮胞；液氮 冻融融（3 3）去）去污剂裂解：用去裂解：用去污剂溶解溶解细胞膜、裂胞膜、裂 解解细胞，胞，释放内容物；用于放内容物；用于组织细胞胞（4 4）酶裂解裂解细胞：植物、胞：植物、细菌和真菌等含有菌和真菌等含有 细胞壁的胞壁的细胞胞第4页/共81页中英联合实验室5剧烈的蛋白裂解方法 常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞
4、壁的细胞，如酵母细胞。常用方法：（1）超声波裂解法：细胞样品 （2）弗氏压碎器：高压下迫使细胞穿过小孔径 而产生剪切力，从而裂解细胞；常用于 含有细胞壁的微生物、藻类 （3）研磨法：常用于固体组织、微生物；冻存于 液氮中，随后研磨成粉末 （4）机械匀浆法：（5）玻璃珠匀浆法：利用剧烈振荡的玻璃珠打破 细胞壁；用于细胞悬液或微生物第5页/共81页中英联合实验室6 细胞裂解胞裂解时，蛋白，蛋白酶释放出来，会影响二放出来，会影响二维电泳的泳的结果，因此需采取措施抑制蛋白果，因此需采取措施抑制蛋白酶的活性。的活性。常用策略：常用策略：（1 1）直接加入）直接加入强变性性剂（2 2）低温、碱性条件下）低
5、温、碱性条件下进行行样品制品制备（3 3）使用蛋白）使用蛋白酶抑制抑制剂（PMSF PMSF、Protease inhibitor cocktail)蛋白蛋白酶抑制抑制剂第6页/共81页中英联合实验室7蛋白沉淀方法硫酸硫酸铵沉淀（沉淀（盐析）析）TCATCA沉淀（三沉淀（三氯醋酸沉淀）醋酸沉淀）丙丙酮沉淀沉淀在丙在丙酮中加中加TCATCA沉淀沉淀用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀沉淀第7页/共81页中英联合实验室8影响二维电泳图谱的杂质1.盐离子、痕量离子、痕量缓冲液和其它冲液和其它带电荷的小分子荷的小分子-透析透析2.内源小分子（如核苷酸、代内源小分子（如核苷
6、酸、代谢物和磷酸）物和磷酸）-TCA/丙丙酮3.离子去离子去污剂-丙丙酮or低温沉淀低温沉淀4.核酸（核酸（RNA、DNA）-DNase/RNase5.多糖多糖-硫酸硫酸铵or苯酚苯酚/醋酸胺醋酸胺6.脂脂类-去去污剂7.酚酚类组分分-PVP8.不溶物不溶物质-离心离心第8页/共81页中英联合实验室9样品制备的分类可溶性可溶性样品制品制备 如血清、血如血清、血浆、尿、尿样、脑脊液以及脊液以及细胞和胞和组织的水溶性提取物。的水溶性提取物。组织样品制品制备细胞胞样品制品制备 体外体外悬浮培养生浮培养生长的的细胞或周期性胞或周期性细胞胞样品（如品（如红细胞、淋巴胞、淋巴细胞）胞）样品分品分级 真核生
7、物真核生物组织蛋白蛋白质第9页/共81页中英联合实验室10可溶性样品制备经过很少的前很少的前处理便可理便可进行行2-DE分析。分析。蛋白蛋白浓度高的度高的样品，如血清、血品，如血清、血浆，可用，可用适当适当样品溶解液稀品溶解液稀释后直接分析；后直接分析；含有含有较低蛋白低蛋白质浓度或度或较高高盐浓度的度的样品，品，可通可通过透析或液相色透析或液相色谱脱脱盐，通，通过冻干、干、对聚乙二醇的透析或聚乙二醇的透析或TCA/丙丙酮沉淀的方法沉淀的方法进行行浓缩。第10页/共81页中英联合实验室11组织样品制备固体组织样品常在裂解液中破碎，最好的方法是将组织在液氮中冷冻破碎。组织样品存在样品异质性问题，
8、通常采用基于免疫亲和技术的正、负性选择，以富集特殊的细胞群，裂解后可直接应用。目前，微量切割技术可以用来从组织样品中获取纯的细胞群，其中最受关注的是激光捕获微量切割技术（LCM）。第11页/共81页中英联合实验室12细胞胞样品制品制备细胞胞样品理想的方法是通品理想的方法是通过离心收集，随离心收集，随后用磷酸后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于冲液清洗并溶于样品品缓冲液。冲液。对于固体基于固体基质中培养的中培养的细胞，胞，应先除去培先除去培养基养基质，用，用PBS或等渗蔗糖溶液清洗或等渗蔗糖溶液清洗细胞胞层，然后再通，然后再通过刮擦法收刮擦法收获细胞；或者加胞；或者加入体入体积裂解裂解缓冲液，直接将基冲液
9、，直接将基质上的上的细胞胞裂解。裂解。第12页/共81页中英联合实验室13样品品预分分级（1 1）蛋白）蛋白质溶解性溶解性进行分行分级（2 2）蛋白）蛋白质在在细胞中不同的胞中不同的细胞器定位胞器定位进行行 分分级，如，如专门分离出分离出细胞核、胞核、线粒体或粒体或 高高尔基体等基体等细胞器的蛋白胞器的蛋白质成分（成分（亚细 胞分胞分级）。）。样品品预分分级不不仅可以提高低丰度蛋白可以提高低丰度蛋白质的的上上样量和量和检测，还可以可以针对某一某一细胞器的胞器的蛋白蛋白质组进行研究。行研究。第13页/共81页中英联合实验室14亚细胞器分离与蛋白质提取亚细胞器的纯化和分级可获得高度纯化和富集的蛋白
10、依据密度差异进行细胞分级一般方法：低速离心分离出细胞核和未破碎细胞，得到上清夜。然后梯度离心分离各种细胞器。第14页/共81页中英联合实验室15Detergent FractionationCellsExtraction withDigitonin/EDTACytoplasmicFractionExtraction withTritonX100/EDTAsupernatentpelletsupernatentpelletsupernatentpelletExtraction withSDS/EDTAOrganelleMembranesNuclearCytoskeletal(in SDS)第15
11、页/共81页中英联合实验室16第16页/共81页中英联合实验室17Subcellular FractionationHuman mitochondrial proteinsHuman nuclear proteins第17页/共81页中英联合实验室18实实 例例1.膜蛋白膜蛋白2.核蛋白核蛋白第18页/共81页中英联合实验室19膜蛋白的提取与分离膜蛋白的提取与分离膜蛋白指多膜蛋白指多肽链跨越脂双跨越脂双层数次的蛋白，数次的蛋白，被定被定义为膜整合蛋白或膜内在蛋白。膜整合蛋白或膜内在蛋白。膜内在蛋白的跨膜膜内在蛋白的跨膜结构域必构域必须折叠形成折叠形成螺螺旋或旋或片片层的二的二级结构，构，膜蛋白
12、膜蛋白处于于细胞胞边界，在界，在细胞的各种生命胞的各种生命活活动中中发挥重要作用。重要作用。第19页/共81页中英联合实验室20膜蛋白提取中有两点需要注意（1）膜蛋白的纯度如何？（2）膜蛋白很难出现在二维凝胶图谱中第20页/共81页中英联合实验室21细胞在水相、去污剂中进行裂解时，细胞膜和内膜网络将会断裂成碎片或颗粒，通过沉淀或分级技术加以分离。但这些技术也能分离膜连的细胞器。两种广泛应用的技术可最低限度地减少样品制备的污染：（1）应用盐，主要是溴化钾，或更多的离液剂进行 清 洗，使与膜相互作用较弱的蛋白分离；（2）应用去污剂分级除去膜样品制备中的可溶性杂 杂质。第21页/共81页中英联合实验
13、室22膜蛋白是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中的蛋白，很难出现在二维凝胶图谱中。为了能够在二维凝胶图谱中，首先必须实现3个条件：（1）保持膜的脂类环境；（2）以可溶形式（去污剂蛋白复合物）从膜上 分离出来；（3）所提取的膜蛋白必须维持可溶状态。第22页/共81页中英联合实验室23以上条件限制了用二维电泳分析膜蛋白，但是现代技术的发展是可以解决这种限制的。例如：新的、宽范围的pH预制干胶条的出现、制备型电泳都可以使之变得容易解决。新的去污剂、离液剂、还原剂以及有机试剂等能够溶解膜内在蛋白。第23页/共81页中英联合实验室24第24页/共81页中英联合实验室25核蛋白的提取与分离核
14、蛋白的提取与分离许多多细胞核蛋白属于中等溶解度的，所以胞核蛋白属于中等溶解度的，所以联合尿素、硫合尿素、硫脲和去和去污剂裂解核蛋白，可裂解核蛋白，可达到足达到足够的分辨率。的分辨率。核基核基质是是BereaneyBereaney和和CoffeyCoffey在在19741974年提出年提出的概念，指非染色的概念，指非染色质结构蛋白及核表面构蛋白及核表面经高高盐离子、核酸离子、核酸酶、去、去污剂抽提后所剩的抽提后所剩的核蛋白网状核蛋白网状结构。构。第25页/共81页中英联合实验室26核基质包括核表面核纤层蛋白、多种低丰度核蛋白、核内不均一核糖核蛋白以及基质相关的DNA结合区。核基质蛋白的提取通常采
15、用Fey和Penman建立的方法。第26页/共81页中英联合实验室27细胞液细胞液缓冲液（缓冲液（0.5Triton X-100、1.2mol/L蛋白酶抑制剂）蛋白酶抑制剂）离心离心沉淀沉淀提取液提取液415min离心离心沉淀沉淀消消化化液液室室温温30min离离心心沉淀（核基质沉淀（核基质蛋白和中间丝）蛋白和中间丝）溶于溶于8mol/L尿素的尿素的蛋白裂解液蛋白裂解液透析除去尿素透析除去尿素超速离心超速离心上清液上清液核蛋白的提取核蛋白的提取第27页/共81页中英联合实验室28 核膜含有几个富集在不同核膜含有几个富集在不同组分的膜整合蛋分的膜整合蛋 白和多蛋白复合物，而且白和多蛋白复合物，而
16、且许多膜整合蛋白多膜整合蛋白 与与结构蛋白的相互作用网构蛋白的相互作用网络不能通不能通过去去污 剂提取。因此，通常会采用不同的提取策提取。因此，通常会采用不同的提取策 略来完成核膜蛋白的分略来完成核膜蛋白的分级制制备。第28页/共81页中英联合实验室29(己己烯乙二醇乙二醇)(一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒)Arabidopsis seedlingHomogenizes1M Hexylene glycol0.5 M PIPES(pH7)10mM MgCl2Pass two miraclothAdd 1%TritonX-100Percoll density gradient Centrifuge
17、(35%/80%)Collect interface nuclear fractionWash&CentrifugeDissolve nuclear protein inLysis buffer 第29页/共81页中英联合实验室30综上所述，随着人类和众多模式生物基因组测序的结束，蛋白质组的研究将会达到一个新的高度。寻找更好的方法进行样品制备和蛋白质提 取，为深入进行蛋白质组研究奠定基础。第30页/共81页中英联合实验室313.2 蛋白质分离技术第31页/共81页中英联合实验室32理想分离方法的要求：1 1）具）具备超高分辨率超高分辨率 2 2）能有效分离不同）能有效分离不同类型的蛋白型的蛋白
18、质第32页/共81页中英联合实验室33目前常用的分离技术1）凝胶电泳技术 1D Gel Electrophoresis 2D Gel Electrophoresis Capillary Electrophoresis2）色谱技术 HPLC MudPIT第33页/共81页中英联合实验室34聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳 聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳（泳（polyacrylamide polyacrylamide gel electropho-resisgel electropho-resis，PAGEPAGE）是以是以聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶作作为支持介支持介质的一种的一种电泳方法。聚泳方法。聚
19、丙丙烯酰胺凝胶具有机械胺凝胶具有机械强度好，有度好，有弹性，透性，透明，化学性明，化学性质稳定，定，对pHpH和温度和温度变化小，没化小，没有吸附和有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介泳支持介质。聚丙。聚丙烯酰胺凝胶是由胺凝胶是由丙丙烯酰胺胺单体体（acrylamideacrylamide，简称称AcrAcr）和和交交联剂N N，N N-甲叉双丙甲叉双丙烯酰胺胺（methylane methylane bisacrylamidebisacrylamide，简称称BisBis）在催化在催化剂作用下作用下合成的。合成的。第34页/共81页中英联合实验室35C
20、HCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=OC=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CHCH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙丙烯酰胺胺聚丙聚丙烯酰胺胺N,NN,N-甲叉双丙甲叉双丙烯酰胺胺第35
21、页/共81页中英联合实验室36凝胶配制凝胶配制时的两个重要参数的两个重要参数T=T=a+ba+bm m100%100%C=C=a+ba+bb b100%100%（5-30%5-30%）（3%3%）第36页/共81页中英联合实验室37二维凝胶电泳 二维凝胶电泳又称双向凝胶电泳（twodimensional gel electrophoresis，2-DE）,是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。Simultaneous separation and detection of 2000 proteins on a 20 x25 cm gelUp to 10,000 proteins
22、can be seen using optimized protocols第37页/共81页中英联合实验室38Why 2D GE?Oldest method for large scale protein separation(since 1975)Still most popular method for protein display and quantificationPermits simultaneous detection,display,purification,identification,quantificationSimple,cost effective,scalable
23、¶llelizable,increasingly reproducible,Provides pI,MW,quantity第38页/共81页中英联合实验室39Steps in 2D GE第39页/共81页中英联合实验室40蛋白质双向电泳第二向电泳第一向电泳第40页/共81页中英联合实验室41基 本 原 理：l第一相是根据不同蛋白质所带电荷量的特性，利用等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点l第一相等电聚焦电泳系统内含有高浓度的脲和非 离子型去垢剂NP-40或兼性离子去污剂CHAPS，而且溶解蛋白质样品的溶液除含有脲和NP-40(
24、CHAPS)外，还含有二硫苏糖醇其作用使蛋白质分子内部的二硫键破坏，达到充分变性l这些试剂不带有电荷，不会影响蛋白质的原有电 荷和等电点。第41页/共81页中英联合实验室42IEF PrinciplesANODE+_CATHODEIncreasing pHpI=8.6pI=6.4pI=5.1第42页/共81页中英联合实验室43Isoelectric FocusingSeparation of basis of pI,not MWRequires very high voltages(5000V)Requires a long period of time(10h)Presence of a p
25、H gradient is criticalDegree of resolution determined by slope of pH gradient and electric field strength第43页/共81页中英联合实验室44Ampholytes vs.IPGAmpholytes are small,soluble,organic molecules with high buffering capacity near their pI(not characterized)Used to create pH gradients via userGradients not st
26、ableBatch-to-batch variation is problematicAn immobilized pH gradient(IPG)is made by covalently integrating acrylamido buffer molecules into acrylamide matrix at time of gel castingStable gradientsPre-made(at factory)Simplified handling第44页/共81页中英联合实验室45IPG StripsStrip Length7.9 cm11.8 cm17.8 cmGel
27、Length7.3 cm 11.0 cm17.1 cmStrip Width3.3 mm3.3 mm3.3 mmGel Thickness0.5 mm0.5 mm0.5 mmpH GradientsStandard3-10,4-7 3-10,4-7 3-10,4-7Overlapping3-6,5-83-6,5-83-6,5-8R=weakly acidic or basic buffering groupCH2=CH-C-NH-R|OAcrylamido buffer第45页/共81页中英联合实验室46Narrow-Range IPG StripspH 4 pH 5pH 5 pH 6pH 4
28、 pH 9第46页/共81页中英联合实验室47Rehydrate IPGstrip&applyprotein samplePlace IPG stripin IEF apparatusand apply current第47页/共81页中英联合实验室48第一相等电聚焦电泳结束后带有蛋白质的凝胶从玻璃管中脱出后（可置于零下80度保存），必须经过第二相SDS电泳分离系统的溶液平衡。所用平衡液为含有疏基乙醇和SDS的第二相浓缩胶缓冲液巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质的充分结合。一般振荡平衡30分钟，使等电聚焦凝胶中的两性电解质和高浓度的脲扩散出胶，使等电聚焦凝胶为第
29、二相浓缩胶缓冲液所平衡。第48页/共81页中英联合实验室49 第二相是根据不同蛋白质分子量大小的特性，通过蛋白质与SDS形成复合物后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的不同分子大小迁移达到分离蛋白质的目的(SDS-PAGE)，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。第49页/共81页中英联合实验室50 SDS是一种阴离子去垢剂，和蛋白质的疏水部位结合，它能破坏蛋白质分子间的共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象。在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可以引起以下的反应：蛋白质本身的电荷变化被屏蔽 氢键被断裂 疏水相互作用被取消 形成椭球形。第50页/共81页中英联合实验室51 在强还原剂巯基乙醇（或是
30、二硫苏糖醇）存在的情况下，由于蛋白质分子内的二硫键已被还原打开不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合，从而形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。第51页/共81页中英联合实验室52 实验证明，当SDS单体浓度大于1mmol/L对于多数蛋白质来说，平均每克蛋白质可结合1.4g SDS。蛋白质分子与SDS结合的复合物，所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有带电量，掩盖了不同种类蛋白质分子之间原有电荷差异。第52页/共81页中英联合实验室53 蛋白质SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同蛋白质SDS复合物，其椭圆棒的短轴长度是恒定的，约为18A；长轴的
31、长度与蛋白质的分子量大小成比例地变化 蛋白质SDS复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再是蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于椭圆棒长度即分子量大小这一因素。第53页/共81页中英联合实验室54SDS PAGE ToolsEquilibrationSDS-PAGE第54页/共81页中英联合实验室55SDS-PAGE PrinciplesLoading GelRunning Gel第55页/共81页中英联合实验室56Mobility&Acrylamide%20020020020045454545456.5200第56页/共81页中英联合实验室57丙丙烯酰胺在凝胶中的百分比
32、胺在凝胶中的百分比 分离胶的分辨范分离胶的分辨范围 15%15-45 kDa15%15-45 kDa 12.5%15-65kDa 12.5%15-65kDa 10%18-75kDa 10%18-75kDa 7.5%30-120kDa 7.5%30-120kDa 5%60-212kDa 5%60-212kDa 第57页/共81页中英联合实验室58 胶上蛋白的检测双向凝胶电泳分离后的蛋白质需要经过染色处理才能进行检测。目前常用的染色方法有：（1）考马斯亮蓝染色 （2）银染 （3）负染 （4）荧光染色 （5）放射自显影第58页/共81页中英联合实验室59不同染色方法的性能一不同染色方法的性能一览表表
33、染色方法灵敏度活细胞应用线性范围与质谱兼容性试剂耗费对软件需求（扫描系统及其它）考马斯亮蓝负染银染荧光染料荧光标记磷触屏稳定同位素标记100ng15ng200pg400pg250pg0.2pg1pgNoNoNoNoNoYesYes337104104105?第59页/共81页中英联合实验室60考马斯亮蓝染色第60页/共81页中英联合实验室61 考考马斯亮斯亮蓝染色程序染色程序1)1)固定：固定：5050乙醇乙醇1010冰醋酸的水溶液，至少冰醋酸的水溶液，至少30 30 min,min,可可过夜；夜；2)2)染色：染色液染色：染色液为4545甲醇甲醇1010冰醋酸冰醋酸0.250.25考考马 斯亮
34、斯亮监G250G250溶液溶液过滤所得，将凝胶染色所得，将凝胶染色2 2h h左右；左右；3)3)脱色：多次更脱色：多次更换脱色液脱色液(25(25乙醇乙醇8 8冰醋酸水溶液冰醋酸水溶液)直至背景脱直至背景脱净，为了加快脱色可略加温度；了加快脱色可略加温度；4)4)保存：脱色后凝胶保存：脱色后凝胶经水洗后水洗后扫描描备份，用保份，用保鲜膜包裹即膜包裹即 可，通常在一个月内均可可，通常在一个月内均可进行行质谱鉴定，若需保存定，若需保存时间 长，可先把需，可先把需鉴定蛋白定蛋白质点切下点切下进步脱色后与步脱色后与-8080 冰箱保存。冰箱保存。第61页/共81页中英联合实验室62传统的蛋白的蛋白质
35、染色方法，可以染色方法，可以检测到到30100ng蛋白蛋白质，其灵敏度，其灵敏度较低。低。其其优点是染色点是染色过程程简单，所需配制的，所需配制的试剂少，操作少，操作简便，无毒性，染色后的背景及便，无毒性，染色后的背景及对比良好，与下游的蛋白比良好，与下游的蛋白质鉴定方法兼容。定方法兼容。胶体考胶体考马斯亮斯亮蓝检测蛋白蛋白质的极限是的极限是810ng。第62页/共81页中英联合实验室63PAGE胶经G250胶体考马斯亮蓝染色后可以获得无背景或很低的背景；估计是因为在胶体染料和溶液中的自由扩散染料间形成平衡，溶液的少量自由染料穿透凝胶基质，有选择地对蛋白质染色，而胶体态的染料排阻在胶外，阻止了
36、背景生成。第63页/共81页中英联合实验室64银 染第64页/共81页中英联合实验室65 银染是非放射性染色方法中灵敏度最高染是非放射性染色方法中灵敏度最高 的，其灵敏度可达的，其灵敏度可达200pg200pg。银染成本染成本较低，是目前仍然是差异蛋白低，是目前仍然是差异蛋白 质组分析中最常用的分析中最常用的显色方法。色方法。第65页/共81页中英联合实验室66 经典银染方法是将二维电泳凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后在AgNO3溶液中浸泡，蛋白与Ag结合，凝胶空白背景中的Ag由于结合不牢而被洗去，而含蛋白质的区域则由于蛋白质中自由氨基与Ag的相互作用而未被洗去，随后在碱性环
37、境中，甲醛溶液将结合在蛋白带上的Ag还原为金属银，银颗粒沉积使蛋白质显示棕黄色或棕黑色。第66页/共81页中英联合实验室67银染可分酸性（AgNO3染色）和碱性（氨银法）两种。酸性染色背景浅，容易控制，所以用的较多，方法多种多样；碱性染色则灵敏度稍高，但背景深，难以控制。第67页/共81页中英联合实验室68第68页/共81页中英联合实验室69 传统银染方法的缺陷染方法的缺陷银染法染法线性关系差；性关系差；由于使用增感戊二由于使用增感戊二醛和温浴和温浴阶段使用甲段使用甲醛，使得蛋白使得蛋白质spot 很很难洗脱；洗脱；解决解决办法？法？（1）戊二）戊二醛和温浴和温浴阶段使用甲段使用甲醛 （2）采
38、用硫代硫酸）采用硫代硫酸钠和和铁氰化化钾脱色脱色 （铁氰化化钾使使银氧化氧化为亚铁氰化化银，后者可与硫，后者可与硫 代硫酸代硫酸钠结合，形成水溶性复合物合，形成水溶性复合物）第69页/共81页中英联合实验室70负负 染染Staining with colloidal Coomassie brilliant blue G-250Negative staining with imidazole-zinc 第70页/共81页中英联合实验室71标准考染方法所存在的一个缺点是染色步骤中含蛋白质固定过程，银染法除固定过程外，还有增敏步骤，这些会将蛋白质提取至胶外，从而减少蛋白产量，使得后续微量化学表征的样
39、品量更少。负染的方法则提高了PAGE胶上蛋白质的回收率。其灵敏度稍高于考染，可达到50ng以下。第71页/共81页中英联合实验室72常用的负染方法有铜染、锌咪唑等。负染结果在凝胶表面会产生半透明背景，其中蛋白质以透明的形式被检测出来。凝胶显示黑色背景或相应的底色。负染的染色过程很快，约需515min即可完成，而且蛋白质的生物活性可以得到保持。第72页/共81页中英联合实验室73荧 光 染 色荧光试剂显色对蛋白质没有固定作用，与 质谱兼容性好，而其灵敏度与银染相仿，但线性范围要高于银染。荧光染色技术更适用于比较蛋白质组学的 研究。第73页/共81页中英联合实验室74SYPRO Ruby是最近很受
40、关注的另外一种荧光染料，它是专利的基于钌的金属鳌合染料。SYPRO Ruby 2-DE和IEF染色仅需一步即可获得PAGE内蛋白质的低背景染色，而且不需要进行长时间脱色步骤，在性能上超过了银染和考马斯亮蓝染色，且灵敏度比银染高330倍。第74页/共81页中英联合实验室75荧 光光 染染 色色FLA-5000-image:Sypro Ruby stained 2 D-gel,brain proteins 第75页/共81页中英联合实验室76最近较新的应用是利用丙基Cy3和甲基Cy5两种染料分别对两种不同蛋白质样品进行荧光标记，并在一块2-D胶上同步进行。两种修饰后染料的激发波长不同，这样在同一快
41、可以用两个波长范围进行扫描，得到的图像经软件匹配即可方便找出两个样品的差异。由于在同一块胶上运行，避免了实验因素对重复性的影响。第76页/共81页中英联合实验室77荧 光光 标 记Cy3/Cy5-labeled 2-DE differential displayCy3/Cy5-labeled 2-DE differential display第77页/共81页中英联合实验室78Trouble Shooting 2D GEHorizontal streaksSample not completely solubilized prior to application on IPG,sample p
42、oorly soluble in rehydration solution,ionic impurities,ionic detergentsVertical streaksInsufficient equilibration,insufficient SDS第78页/共81页中英联合实验室79双向电泳的局限性(1)SDS等去污剂对蛋白质的变性作用是不可逆的。(2)疏水性蛋白质因不能溶于SDS而不适合作2-DE；PI值11的蛋白质；分子量过大或过小的蛋 白质；低丰度蛋白质1ng，都很难被检测到。(3)样品上样量相对少，使检测的灵敏度受到限制。(4)电泳结果需经染色处理，不能直接分析，不同蛋 白
43、质与染料的结合差异较大。(5)不能高通量分析，且耗时。(6)目前尚不能实现完全自动化处理。第79页/共81页中英联合实验室80Conclusions2D gel electrophoresis is still the most popular and powerful method for protein display,separation,visualization and quantitationOffers good to excellent sensitivity and is now very reproducible2D GE is still essential for proteomicsRunning and analyzing 2D gels requires skill,patience and good software第80页/共81页中英联合实验室81感谢您的观看！第81页/共81页