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1、引 物 设 计l引物l引物的重要性l引物设计的原则l引物与PCRl引物设计软件l如何使用Primer Premier 5.0l引物同源性分析引物（primers)l引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。3355Sense primerAntisense primer引物的重要性l在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计原则l引物
2、长度 l碱基分布的均衡性lTm值l引物二级结构l引物3端l引物5端l引物的内部稳定性l引物的保守性与特异性l扩增区域的二级结构引物长度引物长度 l一般为一般为15-30个核苷酸，在做长片段个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的或做某些特殊的PCR时应使用较长的引时应使用较长的引物，但最多不超过物，但最多不超过50个核苷酸。个核苷酸。碱基分布的均衡性碱基分布的均衡性l同一碱基连续出现不应超过同一碱基连续出现不应超过5个个lGC含量一般含量一般40-60%GC含量太低导致引物含量太低导致引物Tm值较低，使用较低值较低，使用较低的退火温度不利于提高的退火温度不利于提高PCR的特异性的特异性GC含量
3、太高也易于引发非特异扩增。含量太高也易于引发非特异扩增。引物引物Tm值值l一般要求：一般要求：55-6555-65。l计算：计算：对于低于对于低于2020个碱基的引物，个碱基的引物，TmTm值可根据值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算来粗略估算对于较长引物，对于较长引物，TmTm值则需要考虑热动力学参值则需要考虑热动力学参数，从数，从“最近邻位最近邻位”的计算方式得到，这也的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。是现有的引物设计软件最常用的计算方式。lTm=H/(S+R*Tm=H/(S+R*lnln(C/4)+16.6 log (
4、C/4)+16.6 log(K+/(1+0.7 K+)-273.15(K+/(1+0.7 K+)-273.15引物二级结构引物二级结构l引物二聚体引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间尽可能避免两个引物分子之间33端有有较端有有较多碱基互补多碱基互补l发夹结构发夹结构尤其是要避免引物尤其是要避免引物33端形成发夹结构，否端形成发夹结构，否则将严重影响则将严重影响DNADNA聚合酶的延伸。聚合酶的延伸。引物引物3端端l 引物的延伸从引物的延伸从33端开始，因此端开始，因此33端端的几个碱基与模板的几个碱基与模板DNADNA均需严格配对，不均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的能进行任何
5、修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致延伸，甚至导致PCRPCR扩增完全失败。考虑扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物到密码子的简并性，引物33端最后一个端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物引物5端端l引物引物55端可以有与模板端可以有与模板DNADNA不配对碱基，不配对碱基，在在55端引入一段非模板依赖性序列。端引入一段非模板依赖性序列。55端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点切位点55端加上适当数量的保护碱基）。端加上适当数量的保护碱基）。55端的某一位点修改某个碱基，人为地在端的某一位点修改某个碱基，
6、人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。产物中引入该位点的点突变以作研究。55端标记放射性元素或非放射性物质（如端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。生物素、地高辛等）。引物的内部稳定性引物的内部稳定性l过去认为，引物过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故有效地进行延伸，故3端最好为端最好为G或或C。l现在的观点认为，引物的现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结端应是相对稳定结构，而构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即性结构，即3端尽可能选用端尽可能选用A或或T，少用，少用G或或C。仅
7、仅仅仅3端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。如果如果3端为富含端为富含G、C的结构，只需的结构，只需3端几个碱基与端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。引物的保守性与特异性l保守性：通用引物保守性：通用引物检测同一类病原检测同一类病原微生物尽可能多的型别微生物尽可能多的型别l特异性：避免非特异性扩增特异性：避免非特异性扩增扩增区域的二级结构扩增区域的二级结构l模板模板DNADNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，的某些区域具有
8、高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。区域。扩增区域的自由能（扩增区域的自由能（G G。）小于）小于58.61kJ/mol58.61kJ/mol引物引物TmTm值与值与PCRPCR产物产物TmTm值相差一般不超过值相差一般不超过3030lTm Tm productproduct=81.5+16.6 log =81.5+16.6 log(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-500/lengt500/lengt引物与PCRl引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L
9、引物浓度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O(单位：L)l退火温度最适退火温度（Ta Opt）=0.3(Tm of primer)+0.7 (Tm of product)25一般采用较引物Tm值低5作为PCR退火温度。引物设计软件lPrimer Premier 5.0 生物软件网下载安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。lOligolprimer 3lThe Primer GeneratorlNetPrimer如何使用如何使用Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0l引物设计引物设计一般引物设计一般引物设计55带酶切位点引物设计带酶切位点引物设计巢式巢式PCRPCR引物设计引物设计多重多重PCRPCR引物设计引物设计l探针设计探针设计l引物评析引物评析引物同源性分析l用用BlastnBlastn软件进行同源性比较软件进行同源性比较尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物为引物选择选择33端与非目的基因不同源的序列作为引端与非目的基因不同源的序列作为引物物选择两个引物选择两个引物33端与同一非目的基因不同源端与同一非目的基因不同源的序列作为引物的序列作为引物