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1、第九章第九章 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第一节第一节 概述概述第二节第二节 凯氏定氮法凯氏定氮法第三节第三节 蛋白质的快速测定法蛋白质的快速测定法第四节第四节 氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定第一节第一节概述概述v蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养指标；中重要的营养指标；v测定蛋白质含量对于评价食品营养价值、测定蛋白质含量对于评价食品营养价值、提高产品质量等具有重要意义；提高产品质量等具有重要意义；v主要含有主要含有C、H、O、N，含，含N是区别于其他是区别于其他有机化合物的主要标志；有机化合物的主要标志；v蛋白质系数：蛋白质系数
2、：指指1份氮相当于蛋白质的份数。份氮相当于蛋白质的份数。一般蛋白质含氮量一般蛋白质含氮量16%，蛋白质系数为，蛋白质系数为6.25。不同食品蛋白质系数有所差异。不同食品蛋白质系数有所差异。v蛋白质的测定方法分两大类：蛋白质的测定方法分两大类：利用蛋白质的利用蛋白质的共性共性，即含，即含氮量、肽键和折射率氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；等测定蛋白质含量；利用蛋白质中特定利用蛋白质中特定氨基酸残基氨基酸残基、酸性酸性和和碱性基团碱性基团以及以及芳香基团芳香基团等测等测定蛋白质含量。定蛋白质含量。v食品种类多，食品种类多，pro含量不同，碳水化合物，脂肪和维生素等含量不同，碳水化合物，脂肪和维生
3、素等干扰成分很多。干扰成分很多。凯氏定氮法凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数，是测定蛋白质最常用的方法。具乘以相应的蛋白质系数，是测定蛋白质最常用的方法。具有准确、简便的优点。有准确、简便的优点。v其他方法：双缩脲法、紫外吸收法、水杨酸比色法、福林其他方法：双缩脲法、紫外吸收法、水杨酸比色法、福林-酚比色法、考马斯亮蓝比色法等。酚比色法、考马斯亮蓝比色法等。v氨基酸测定的常用方法：双指示剂甲醛滴定法、茚三酮比氨基酸测定的常用方法：双指示剂甲醛滴定法、茚三酮比色法、自动分析仪法。色法、自动分析仪法。v新新鲜鲜食食品品中中含含氮氮化化合合物物以以蛋蛋
4、白白质质占占优优势势，所所以以检检验验食食品品中中蛋蛋白白质质时时，往往往往只只限限于于测测定定总总氮氮量量，然然后后乘乘以以蛋蛋白白质质换换算算系系数数，得得到到蛋蛋白白质质含含量量，实实际际上上包包括括核核酸酸、生生物物碱碱，含含氮氮类类脂脂、卟卟啉啉和和含氮色素含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质粗蛋白质。v三三聚聚氰氰胺胺事事件件：俗俗称称密密胺胺、蛋蛋白白精精，为为含含氮氮杂杂环环有有机机化化合合物物，被被用用作作化化工工原原料料，主主要要用用于于木木材材加加工工、装装饰饰板板、涂涂料料、纸纸张张、纺纺织织、皮皮革革等等行行业业。三三聚聚氰氰胺胺色色白
5、白无无味味，含含N N约约66%66%，非非法法掺掺进奶粉等食品中，可提升蛋白质的检出量。进奶粉等食品中，可提升蛋白质的检出量。第二节第二节凯氏定氮法凯氏定氮法三聚氰胺vK2SO4的作用：的作用：消化过程中提高溶液沸点从而加快有机物分解。消化过程中提高溶液沸点从而加快有机物分解。一般纯一般纯H2SO4沸点为沸点为340，K2SO4与硫酸反应生成与硫酸反应生成KHSO4，可以提高温度，可以提高温度至至400以上，加快有机物分解。以上，加快有机物分解。硫酸钾加入量不能太大，否则易造成温度过高，生成的铵盐分解损失。硫酸钾加入量不能太大，否则易造成温度过高，生成的铵盐分解损失。也可用也可用Na2SO4
6、等其他盐类来提高沸点。等其他盐类来提高沸点。vCuSO4的作用：的作用：作为催化剂，加速反应进程；作为催化剂，加速反应进程；消化完全的指示作用：消化完全的指示作用：反应中不断生成硫酸亚铜褐色沉淀，消化完全后，不再反应中不断生成硫酸亚铜褐色沉淀，消化完全后，不再有沉淀生成，变为蓝绿色澄清透明；有沉淀生成，变为蓝绿色澄清透明；也可以用氧化汞、汞、锡粉、二氧化钛等代替。也可以用氧化汞、汞、锡粉、二氧化钛等代替。v其他：其他：消化过程通常也加入少量消化过程通常也加入少量H2O2，KClO等强氧化剂，以加速有机物氧等强氧化剂，以加速有机物氧化分解。化分解。v反应反应式式v特点特点优优应用范围广、灵敏度高
7、、回收率好，不需昂贵仪器；应用范围广、灵敏度高、回收率好，不需昂贵仪器；缺缺操作费时，产生有害气体。操作费时，产生有害气体。v操作步骤操作步骤v准确称取样品准确称取样品0.50-2.00g(半固体半固体2-5g，液体，液体10-20mL)于于500ml凯氏瓶中凯氏瓶中加加10g无水无水K2SO4+0.5gCuSO4加加20ml浓浓H2SO4通风橱中先以通风橱中先以小火小火加热加热泡沫消失后泡沫消失后加大火力加大火力消化至透明消化至透明无黑粒无黑粒摇动瓶子摇动瓶子(使瓶壁炭粒溶于使瓶壁炭粒溶于硫酸中硫酸中)继续消化继续消化30分钟分钟至样液呈绿色透明；至样液呈绿色透明；v停止消化停止消化冷却冷却
8、加加200ml水水连接蒸馏装置连接蒸馏装置用硼酸作吸收液用硼酸作吸收液在凯氏在凯氏瓶中加波璃珠数粒和瓶中加波璃珠数粒和80ml50%NaOH立即接好装置立即接好装置加热加热至到凯氏瓶至到凯氏瓶内残液减少到三分之一时内残液减少到三分之一时(200-250mL)，取出用水冲洗；，取出用水冲洗；v用用0.1mol/LHCl滴定滴定(终点终点:蓝色蓝色微红微红)v同时做空白实验：除不加样品外，从消化开始所有操作相同。同时做空白实验：除不加样品外，从消化开始所有操作相同。一、常量凯氏定氮法一、常量凯氏定氮法计算公式计算公式滴定样品消耗的标准滴定样品消耗的标准盐酸溶液体积盐酸溶液体积滴定空白消耗的标准滴定
9、空白消耗的标准盐酸溶液体积盐酸溶液体积盐酸标准溶盐酸标准溶液浓度液浓度样品的质样品的质量量蛋白质蛋白质系数系数6.25氮氮mol质量，质量，14g/molv所用试剂溶液应用所用试剂溶液应用无氨蒸馏水无氨蒸馏水配制。配制。v消消化化时时不不要要用用强强火火，应应保保持持和和缓缓沸沸腾腾，以以免免粘粘附附在在凯凯氏氏瓶瓶内内壁壁上上的的含含氮氮化化合合物物在在无无硫硫酸酸存存在在的的情情况况下下未未消消化化完完全全造造成成氮氮损失。损失。v样样品品中中若若含含脂脂肪肪或或糖糖较较多多时时，消消化化过过程程中中易易产产生生大大量量泡泡沫沫，为为防防止止泡泡沫沫溢溢出出瓶瓶外外，在在开开始始消消化化时
10、时应应用用小小火火加加热热，并并时时时时摇动。摇动。v蒸蒸馏馏完完毕毕后后，应应先先将将冷冷凝凝管管下下端端提提离离液液面面，清清洗洗管管口口再再蒸蒸1分钟后关掉热源分钟后关掉热源(避免造成吸收液倒吸避免造成吸收液倒吸)；v吸吸收收液液中中的的混混合合指指示示剂剂在在碱碱性性溶溶液液中中呈呈绿绿色色，在在中中性性溶溶液液中中呈呈灰灰色，在酸性溶液中呈色，在酸性溶液中呈红红色。色。说明说明v原理：原理：与常量法同，与常量法同，3点区别：原理上蒸馏采用点区别：原理上蒸馏采用水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法；消化液只取一部分进行蒸馏（常量法为全部）；装置不消化液只取一部分进行蒸馏（常量法为全部）；装置不同。
11、同。v仪器和试剂、操作方法仪器和试剂、操作方法：P222v说明说明蒸蒸馏馏前前给给水水蒸蒸汽汽发发生生器器内内装装水水至至2/3容容积积处处，加加甲甲基基橙橙指指示示剂剂数数滴滴及及硫硫酸酸数数mL以以使使其其始始终终保保持持酸酸性性(避避免免水水中中的的氨氨被被蒸蒸出出)；蒸蒸馏馏时时蒸蒸汽汽发发生生要要均均匀匀充充足足，蒸蒸馏馏过过程程中中不不得得停停火火断断汽汽(否否则则将发生倒吸将发生倒吸)；加加碱碱要要足足量量，加加后后漏漏斗斗迅迅速速加加盖盖，并并应应采采用用水水封封措措施施(避避免免氨氨逸出造成损失逸出造成损失)。1原理原理、仪器、仪器v消消化化装装置置：由由优优质质玻玻璃璃制制
12、成成的的凯凯氏氏消消化化瓶瓶及及红红外外线线加加热热装装置置组合而成的消化炉。组合而成的消化炉。v自自动动凯凯氏氏定定氮氮仪仪：该该装装置置内内具具有有自自动动加加碱碱蒸蒸馏馏装装置置、自自动动吸吸收和滴定装置及自动数字显示装置。收和滴定装置及自动数字显示装置。2试剂试剂v除硫酸铜与硫酸钾制成除硫酸铜与硫酸钾制成片剂片剂外，其它试剂同常量凯氏定氮法。外，其它试剂同常量凯氏定氮法。三、自动凯氏定氮法三、自动凯氏定氮法凯氏定氮法的优缺点凯氏定氮法的优缺点优点优点缺点缺点可用于所有食品的蛋白质分可用于所有食品的蛋白质分析中析中测定的是总有机氮，而不只是测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮蛋白质氮结果准
13、确结果准确实验时间长（至少实验时间长（至少2h以上）以上）可测定样品中微量的蛋白质可测定样品中微量的蛋白质 试剂有腐蚀性试剂有腐蚀性1）如何只测出蛋白质中的氮：样品可先在碱性条件下萃取蛋）如何只测出蛋白质中的氮：样品可先在碱性条件下萃取蛋白质，然后用三氯醋酸或磺基水杨酸沉淀蛋白质。白质，然后用三氯醋酸或磺基水杨酸沉淀蛋白质。2）除凯氏定氮法和紫外分光法外：其他的所有方法对纯化蛋）除凯氏定氮法和紫外分光法外：其他的所有方法对纯化蛋白质的测定都需要使用标准或参比蛋白质，而对于分析某白质的测定都需要使用标准或参比蛋白质，而对于分析某一具体食品来源的蛋白质，选择适当的标准蛋白质非常重一具体食品来源的蛋
14、白质，选择适当的标准蛋白质非常重要。要。第三节第三节蛋白质快速测定方法蛋白质快速测定方法(一一)双缩脲法双缩脲法(Biuret法法)v原理原理在在碱性条件碱性条件下，下，Cu2+和肽类和肽类(如双缩脲、多肽和所有蛋白如双缩脲、多肽和所有蛋白质质)生成生成紫红紫红色色复合物（双缩脲反应）复合物（双缩脲反应），吸收波长为，吸收波长为550560nm，比色法测得的吸光度值，比色法测得的吸光度值(OD值值)与样品中的与样品中的蛋白含量成正比。以标准蛋白质制作标准曲线，求出样蛋白含量成正比。以标准蛋白质制作标准曲线，求出样品蛋白质含量。品蛋白质含量。H2NNH2O+NHNH2OH150-1600CH2N
15、NHNH2OOCuSO4/NaOH有有色色络络合合物物双缩脲双缩脲蛋白质蛋白质双缩脲双缩脲脲脲脲脲第三节第三节蛋白质快速测定方法蛋白质快速测定方法(一一)双缩脲法双缩脲法(Biuret法法)v应用应用该该法法已已被被用用于于谷谷物物、肉肉类类、大大豆豆及及动动物物饲饲料料的的蛋蛋白白质质定定性测定。性测定。v谷物样品谷物样品(cerealchemistry,1961,38:467-479)双双缩缩脲脲溶溶液液：15mL氢氢氧氧化化钾钾溶溶液液（10mol/L）和和2.5g酒酒石石酸酸钾钾钠钠用用900mL蒸蒸馏馏水水溶溶解解，在在持持续续搅搅拌拌下下缓缓慢慢加加入入30mL五水硫酸铜溶液（五水
16、硫酸铜溶液（4%），定容至），定容至1L。测测定定：标标准准曲曲线线绘绘制制：采采用用凯凯氏氏定定氮氮法法测测出出蛋蛋白白质质含含量量的的样样品品作作为为标标准准蛋蛋白白质质样样品品，按按蛋蛋白白质质含含量量40、50、60、70、80、90mg分分别别称称取取标标准准蛋蛋白白质质样样于于6支支50mL比比色管，然后按照以上样品测定步骤，测定吸光度色管，然后按照以上样品测定步骤，测定吸光度。第三节第三节蛋白质快速测定方法蛋白质快速测定方法(一一)双缩脲法双缩脲法(Biuret法法)v谷物样品谷物样品测测定定：样样品品测测定定：称称取取5005mg样样品品，加加入入2mL四四氯氯化化碳碳湿湿润润
17、样样品品，加加入入50mL双双缩缩脲脲溶溶液液，塞塞上上瓶瓶盖盖（铝铝或或玻玻璃璃材材料料）在在振振荡荡器器上上振振摇摇60min，然然后后4500转转/min下下离离心心15min；取取上上清清液液于于550nm处处读读取取吸吸光光度度。由由标标准准曲曲线线查查出出蛋蛋白白质质的质量（的质量（mg），由此可计算出样品的蛋白质的含量。），由此可计算出样品的蛋白质的含量。第三节第三节蛋白质快速测定方法蛋白质快速测定方法(一一)双缩脲法双缩脲法(Biuret法法)v豆类样品（豆类样品（JournalofFoodScience，1965，30：307-311）双双 缩缩 脲脲 溶溶 液液：930mL
18、蒸蒸 馏馏 水水+10mL氢氢 氧氧 化化 钾钾 溶溶 液液（10mol/L）+20mL酒酒石石酸酸钾钾钠钠溶溶液液（25%），在在剧剧烈烈搅搅拌拌下缓慢加入下缓慢加入40mL硫酸铜溶液（硫酸铜溶液（4%CuSO45H2O）。）。测测定定：称称取取0.10.2g样样品品于于125mL锥锥形形瓶瓶中中，加加入入2mL四四氯氯化化碳碳湿湿润润分分散散样样品品，加加入入50mL双双缩缩脲脲溶溶液液，塞塞上上瓶瓶盖盖在在振振荡荡器器上上振振摇摇15min，静静置置60min；然然后后4000转转/min下下离离心心10min；取上清液于；取上清液于550nm处读取吸光度。处读取吸光度。第三节第三节蛋白
19、质快速测定方法蛋白质快速测定方法(一一)双缩脲法双缩脲法(Biuret法法)v优缺点优缺点优点优点缺点缺点费用低，速度快费用低，速度快（30min内）内）灵敏度偏低，分析时至少需要灵敏度偏低，分析时至少需要24mg蛋蛋白质白质几乎没有物质干扰测定几乎没有物质干扰测定不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同不需要测定非多肽或非蛋不需要测定非多肽或非蛋白质来源的氮白质来源的氮若有高浓度的脂或碳水化合物存在时，若有高浓度的脂或碳水化合物存在时，最终的反应溶液可能会呈乳白色最终的反应溶液可能会呈乳白色不是一个测量绝对值的方法，必须用已不是一个测量绝对值的方法，必须用已知浓度
20、的蛋白质或经凯氏定氮法校正。知浓度的蛋白质或经凯氏定氮法校正。含含脂肪高脂肪高的样品应预先用的样品应预先用醚醚抽出弃去抽出弃去(二二)福林酚比色法福林酚比色法(Lowry法法)v原理原理蛋白质与蛋白质与福林福林酚酚(Folin)试剂试剂反应，产生反应，产生蓝色复合物蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜离子发生双肽键与碱性铜离子发生双缩脲反应缩脲反应，同时，同时蛋白中蛋白中存在的存在的酪氨酸与色氨酸酪氨酸与色氨酸同试剂同试剂中的中的磷钼酸磷钼酸-磷钨酸反应磷钨酸反应产生产生颜色颜色。呈色强度。呈色强度（750nm）与蛋白质含量呈正比，是检测水溶性蛋白）与蛋白质
21、含量呈正比，是检测水溶性蛋白含量的最灵敏的经典方法之一。含量的最灵敏的经典方法之一。(二二)福林酚比色法福林酚比色法(Lowry法法)v方法方法1）将待测的蛋白质样品稀释成合适的浓度）将待测的蛋白质样品稀释成合适的浓度(20100g)2）加入酒石酸钾钠）加入酒石酸钾钠-碳酸钠溶液碳酸钠溶液3）冷却并在室温下放置）冷却并在室温下放置10min后，加入硫酸铜后，加入硫酸铜-酒石酸酒石酸钾钠钾钠-氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液4）加入新配制的福林酚溶液，混匀，在）加入新配制的福林酚溶液，混匀，在50保温保温10min5）与）与750nm处比色读数处比色读数6）建立标准曲线）建立标准曲线(三三)考马斯亮蓝比
22、色法（考马斯亮蓝比色法（Bradford布兰德福特法）布兰德福特法）v原理原理考考马马斯斯亮亮蓝蓝G250是是一一种种蛋蛋白白质质染染料料，与与蛋蛋白白质质通通过过范范德德华华力力结结合合，使使蛋蛋白白质质染染色色（蓝蓝色色），在在595620nm出出呈呈现现最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。v试剂试剂牛牛血血清清蛋蛋白白标标准准液液：称称取取牛牛血血清清蛋蛋白白10mg，用用蒸蒸馏馏水水配配成成100 g/mL标准溶液。标准溶液。染染料料试试剂剂：称称取取考考马马斯斯亮亮蓝蓝G25060mg，溶溶于于100mL3%过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，储存于棕
23、色瓶中备用。过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，储存于棕色瓶中备用。v测定测定吸吸取取样样品品溶溶液液2mL加加染染料料试试剂剂2mL混混匀匀以以介介质质溶溶液液调零调零测定测定A620nm查标准曲线，求出蛋白质含量。查标准曲线，求出蛋白质含量。v说明及适用范围说明及适用范围已成功应用于测定麦芽汁已成功应用于测定麦芽汁、啤酒和马铃薯中的蛋白质含量。啤酒和马铃薯中的蛋白质含量。适用于可溶性蛋白质含量的测定适用于可溶性蛋白质含量的测定本本法法快快速速、简简单单，适适合合大大量量样样品品测测定定，灵灵敏敏度度与与福福林林-酚酚法法相近，但相近，但不受酚类、游离氨基酸和小分子肽不受酚类、游离氨基酸和小分子
24、肽的影响。的影响。(四四)280nm紫外吸收法紫外吸收法v原理原理由于蛋白质中存在含有由于蛋白质中存在含有共轭双键的的酪氨酸和色氨酸共轭双键的的酪氨酸和色氨酸，因此具有因此具有紫外吸收性质紫外吸收性质，在，在280nm处，蛋白质溶液的光处，蛋白质溶液的光吸收值与其浓度成正比，可定量测定。吸收值与其浓度成正比，可定量测定。v特点特点优优操作简便迅速；操作简便迅速；缺缺干扰多（非蛋白成分紫外吸收；光散射作用）；干扰多（非蛋白成分紫外吸收；光散射作用）；在食品分析中应用不多。在食品分析中应用不多。v试剂试剂标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液(两种，任选其一两种，任选其一)：牛牛血血清清蛋蛋白白标标准准液液
25、：称称取取经经凯凯氏氏定定氮氮法法校校正正的的结结晶晶牛牛血血清清蛋蛋白白，用用水水配成配成1mg/mL的蛋白质溶液。的蛋白质溶液。卵卵清清蛋蛋白白标标准准液液：称称取取经经凯凯氏氏定定氮氮法法校校正正的的卵卵清清蛋蛋白白，用用0.9%NaCl配配成成1mg/mL的蛋白质溶液。的蛋白质溶液。v测定测定吸吸取取1mL样样品品溶溶液液加加蒸蒸馏馏水水至至4mL以以蒸蒸馏馏水水调调零零测测280nm处的吸光值处的吸光值A查标准曲线查标准曲线得样品蛋白质含量。得样品蛋白质含量。v说明说明本本法法测测定定与与标标准准蛋蛋白白中中酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸含含量量差差异异较较大大的的蛋蛋白质，误差较大。
26、白质，误差较大。(五五)水杨酸比色法水杨酸比色法v原理原理样品中的蛋白质经样品中的蛋白质经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与定的酸度和温度下与水杨酸钠和次氯酸钠水杨酸钠和次氯酸钠作用生成作用生成蓝蓝色的化合物色的化合物，在，在660nm处比色测定，求出样品含氮量，处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。计算蛋白质含量。v试剂试剂氮氮标标准准溶溶液液(1.0mg/mL，配配制制方方法法P230)：使使用用时时稀稀释释至至2.50 g/mL。空空白白酸酸溶溶液液、磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲溶溶液液、水水杨杨酸酸钠钠溶溶液液、次次氯氯酸钠溶液等酸钠溶液等(
27、配制方法见课本配制方法见课本)v测定方法测定方法1.标准曲线绘制标准曲线绘制取取6个个25mL容容量量瓶瓶加加空空白白酸酸溶溶液液2mL加加磷磷酸酸缓缓冲冲液液(控控制制适适宜宜酸酸度度)5mL加加水水至至15mL加加水水杨杨酸酸钠钠溶溶液液5mL37水水浴浴15min加加次次氯氯酸酸钠钠溶液溶液2.5mL37水浴水浴15min取出于取出于660nm比色比色绘制标准曲线。绘制标准曲线。2.样品消化样品消化准准确确称称样样0.201.00g于于凯凯氏氏瓶瓶加加15mlH2SO4和和5g催催化化剂剂电电炉炉上上加加热热到到沸沸腾腾加加大大火火力力消消化化出出现现暗暗绿绿色色摇摇动动瓶瓶子子至至完完
28、全全澄澄清清冷冷却却移移至至25ml容量瓶定容。容量瓶定容。3.测定测定准准确确吸吸取取消消化化溶溶液液10ml于于100ml容容量量瓶瓶中中定定容容准准确确吸吸2ml于于25ml容容量量瓶瓶中中加加5ml磷磷酸酸缓缓冲冲液液以以下下操操作作与与标标准准曲曲线线绘绘制制的的步步骤骤相相同同。并并以试剂空白对照，测得样液的吸光度，从标准曲线查出其含氮量。以试剂空白对照，测得样液的吸光度，从标准曲线查出其含氮量。4.计算计算式中：式中：c从标准曲线上查得的含氮量，从标准曲线上查得的含氮量，g；K为样品溶液的稀释倍数；为样品溶液的稀释倍数；M为样品的质量，为样品的质量，g；F为单换算为蛋白质的系数为
29、单换算为蛋白质的系数5.说明说明样品消化后当天测定重现性好；样品消化后当天测定重现性好；显色与温度有关，严格控制温度。显色与温度有关，严格控制温度。(一一)双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法(二二)茚三酮比色法茚三酮比色法第四节第四节氨基酸的测定氨基酸的测定vv原理原理原理原理氨基酸具有酸性-COOH和碱性-NH2。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，碱性消失。用强碱标准溶液滴定-COOH，测定氨基酸总量。vv操作方法操作方法操作方法操作方法移取含氨基酸约20-30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中1份加入3滴中
30、性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点(中和样液中其它酸性物质)；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1分钟，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的碱液mL数。(一一)双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法v计算计算计算计算c为氢氧化钠标准溶液的浓度，为氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1为用为用中性红指示剂中性红指示剂滴定时消耗的氢氧化钠标准溶液体积，滴定时消耗的氢氧化钠标准溶液体积，ml;V2为用为用百里酚酞指示剂百里酚酞指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml;
31、m为测定用样品溶液相当于样品的质量，为测定用样品溶液相当于样品的质量，g;0.014为氮的摩尔质量，为氮的摩尔质量，g/molv说明及注意事项说明及注意事项说明及注意事项说明及注意事项此此法法简简便便快快速速，适适用用于于测测定定食食品品中中的的游游离离氨氨基基酸酸。发发酵酵工工业业中中常常用于测定发酵液氨基氮含量；用于测定发酵液氨基氮含量；若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定；若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定；脯氨酸测定结果偏低；酪氨酸偏高；铵存在也使结果偏高。脯氨酸测定结果偏低；酪氨酸偏高；铵存在也使结果偏高。v原理原理 碱性条件下，氨基酸的氨基与茚三酮中的羰基缩合，生成蓝
32、紫色化合物。可用比色法定量测定。v试剂试剂磷酸缓冲液(pH.8.04)、氨基酸标准溶液 2%茚三酮溶液称茚三酮1g溶于35mL热水加入40mg氯化亚锡(SnCl2H2O)(氯化亚锡有还原性，防止茚三酮氧化)搅拌过滤于冷暗处过夜定容至50mL(二二)茚三酮比色法茚三酮比色法v操作方法操作方法绘制标准曲线吸取标液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于6个25ml容量瓶加水+茚三酮试剂+缓冲液沸水浴加热15分钟(保证缩合显色反应充分)迅速冷却、定容静置15分钟 570nm下测吸光值绘制标准曲线。样品测定样品测定取澄清样品溶液1-4mL，按标准曲线操作，测定吸光值。v注意事项注意事项茚三
33、酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：取10g茚三酮容于40ml热水中，加1克活性炭(脱色)，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。(二二)茚三酮比色法茚三酮比色法v应用举例应用举例茶叶中游离氨基酸总量的测定茶叶中游离氨基酸总量的测定（1）样样品品预处预处理理v 称取3g（准确至0.001g）磨碎试样于500mL锥形瓶中，加煮沸的蒸馏水450mL，移入沸水浴中，浸提45min（每隔10min摇动一次），浸提完毕后立即趁热减压过滤，残渣用少量热蒸馏水洗涤23次，将滤液转入5
34、00mL容量瓶中，冷却后用水定容。(二二)茚三酮比色法茚三酮比色法v应用举例应用举例茶叶中游离氨基酸总量的测定茶叶中游离氨基酸总量的测定（2）样样品品测测定定v准确吸取试液1mL于25mL比色管中，加入pH8.0磷酸盐缓冲液0.5mL和2%茚三酮溶液0.5mL，沸水中加热15min，冷却后加水定容至25mL，放置10min，用0.5cm比色皿于570nm处，以试剂空白溶液作仪器调零管，测定吸光度。（3）标标准曲准曲线绘线绘制制v分别吸取1mL谷氨酸系列标准工作液（0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL）于25mL比色管中，后续操作同样品的测定。(二二)茚三酮比色法茚三酮比色法