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1、7 7 蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术I.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)SDS-PAGE原理蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是蛋白质分析）是蛋白质分析过程中最常用的技术，通常在电泳分离时，其迁移率主要取过程中最常用的技术，通常在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在在PAGE中加入阴离子去污剂中加入阴离子去污剂SDS,SDS将蛋白质的二硫键、将蛋白质的二硫键、氢键及梳水键打开，使蛋白质变性，氢键及梳水键打开，使蛋白质变性，SDS将包裹在
2、变性蛋白将包裹在变性蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子；同时，由于表面，使蛋白质成为刚性分子；同时，由于SDS带有大量负带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。至此情况下，不同电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。至此情况下，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于带有的蛋白质分子的迁移率主要决定于带有的SDS量，即蛋白质分量，即蛋白质分子的大小。因此利用子的大小。因此利用SDS-PAGE可测定蛋白质的分子量。可测定蛋白质的分子量。试剂试剂 1.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis)称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，过滤后存于棕色瓶中，于4保存。2.4X分离胶缓
3、冲液 称取Tris 1817g，加入10%SDS贮备液4ml，用12mol/L HCl调pH至8，8，定容至100ml。3.4X浓缩胶缓)中液 称取Tris 6.06g，加入10%SDS 4ml，用l2mol/L HCI调pH至68，定容至100ml。4.10%过硫酸铵 称取过硫酸铵0.5g，加水至5ml。本储存液应现配现用。5.10X电极缓冲液 称取Tris 30g、甘氨酸144g，加入10%SDSl00ml，定容至1000ml。6.2X样品缓冲液 称取蔗糖2g(或甘油2m1)，加入10%SDS 2ml，溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml、-巯基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。7
4、.染色液 称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入甲醇450ml，冰乙酸l00ml、水650ml。8.脱色液 甲醇100ml，冰乙酸100ml，加水830m1.(2).将混合液充分混合后，缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平板电泳槽里的狭槽中，注意在本操作过程中不能产生任何气泡。然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水。(3).置于室温下15-30分钟，使凝胶聚合完全(在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线)。除去上层水相，然后再用水或浓缩胶缓冲液(0.125mol/m1Tris-HCI，pH6.8,0.1%SDS)洗凝胶表面，准备灌制浓缩胶。2.浓缩胶的制备浓缩胶的制备(1).将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰
5、胺单体储备液0.6ml，浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后，立即灌胶。(2).将预先制备好的浓缩胶浓缩胶慢慢地灌进狭槽中，然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹心槽上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地去除粘附在梳齿顶部的小气泡，待聚合完全后即可拔去梳子，准备电泳。3.样品制备及电泳样品制备及电泳(1).样品处理样品处理：蛋白质样品和分子量标准蛋白质在上样电泳前均需变性。通常是将样品蛋白质溶液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf管中，将混合物置于95-100加热5分钟，立即置于冰上，或于-20储存，以便再次分析时使用。(2).上样上样：样
6、品制备好以后，即可上样电泳。先将样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽中也加满电泳缓冲液。处理完毕后，根据实验的需要加样电泳。(3).电泳电泳：通常使用稳流的方式进行电泳，电流一般为18mA，时间2小时即可。II.双向凝胶电泳双向凝胶电泳 (2-DE)双向凝胶电泳技术基本原理双向凝胶电泳技术基本原理 1975年年Ofarrell和和Klose首先在两个实验室分别建立首先在两个实验室分别建立了二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术了二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-D
7、电泳电泳)，亦称双，亦称双向凝胶电泳技术向凝胶电泳技术.基本原理基本原理是利用不同蛋白质具有不同等电点是利用不同蛋白质具有不同等电点(pI)和和不同分子量大小的特点将它们分离。他们将高分辨率的不同分子量大小的特点将它们分离。他们将高分辨率的等电聚集电泳等电聚集电泳(isoelectrofocusing，IEF)和和SDS聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)联合组成双向电泳，第一向联合组成双向电泳，第一向为为IEF，采用经典的两性电解质载体在电流作用下形成，采用经典的两性电解质载体在电流作用下形成pH梯度，依据梯度，依据pI的不同进行分离；第二向利用的不同进行分离；第二向利用
8、SDS-PAGE根据分子量大小进行分离。根据分子量大小进行分离。双向电泳的基本程序双向电泳的基本程序1.样品制备样品制备1.1 一般性原则一般性原则1.2 样品制备程序样品制备程序1.2.1 培养细胞样品处理方法培养细胞样品处理方法 1.2.2 组织样品处理方法组织样品处理方法2.第一向等电聚焦（第一向等电聚焦（IEF）2.1 IPG胶条的水化和电泳胶条的水化和电泳2.1.1 试剂试剂2.1.2.实验步骤实验步骤2.2 IPG胶条的平衡胶条的平衡 2.2.3 实验步骤实验步骤3.第二向第二向 SDS电泳电泳3.1 垂直垂直SDS-PAGE3.1.1 溶液溶液 3.1.2 灌胶步骤灌胶步骤 3.
9、1.3 电泳步骤电泳步骤4.2-DE胶蛋白质点的检测胶蛋白质点的检测4.1 考马斯亮兰染色考马斯亮兰染色 4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序经典的考马斯亮兰染色程序4.1.2 Neuhoff胶体考染法胶体考染法4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法热考马斯亮兰染色及二次染色法4.2 硝酸银染色硝酸银染色1.1.一般性原则一般性原则 样品制备是双向电泳（样品制备是双向电泳（2-DE2-DE）中最为关键的一步，）中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响这一步处理的好坏将直接影响 结果。目前并没有一结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都个通用的制备方法，尽管处理方法
10、是多种多样，但都遵循几个基本的原则遵循几个基本的原则：1 1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；的总蛋白，减少蛋白质的损失；2 2）减少对蛋白质的人为修饰；）减少对蛋白质的人为修饰；3 3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。使蛋白质处于完全变性状态。样品制备需要四种主要的试剂样品制备需要四种主要的试剂变性剂变性剂(chaotropes)：主要包括尿素（：主要包括尿素（Urea）和酸等。）和酸等。破坏蛋白质互作，破坏二、三级结构。破坏蛋白质互作，破
11、坏二、三级结构。表面活性剂（表面活性剂（sufactants），），也称去污剂，早期常使用也称去污剂，早期常使用 NP-40、Triton X-100、Tween等非离子去垢剂，近几年较多等非离子去垢剂，近几年较多的改用如的改用如 CHAPS、Zwittergent、SB3-10等双性离子去污等双性离子去污剂。有助于溶解膜蛋白，与脂类分离等。剂。有助于溶解膜蛋白，与脂类分离等。还原剂（还原剂（reducing agents），），最常用的是二硫苏糖醇最常用的是二硫苏糖醇（DTT），硫脲（），硫脲（thiourea）；也有用二硫赤藓糖醇）；也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（）以及磷酸三
12、丁酯（TBP）等。用于还原二硫键或）等。用于还原二硫键或防止蛋白质氧化。防止蛋白质氧化。蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂（如（如 EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails）,Tris-base以及以及核酸酶核酸酶。裂解缓冲液选择的注意事项裂解缓冲液选择的注意事项样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同，通样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同，通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除核在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除核酸、脂、多糖等大分子以及盐类
13、小分子等影响蛋白酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子等影响蛋白质可溶性和质可溶性和双向电泳双向电泳重复性的物质。重复性的物质。大分子的存在会阻塞凝胶孔径大分子的存在会阻塞凝胶孔径盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏 凝胶条。凝胶条。去除影响因子的方法去除影响因子的方法核酸的去除：核酸的去除：可采用超声或核酸酶处理。超声处理可采用超声或核酸酶处理。超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的酸酶则会出现在最终的 2D 2D 胶上。胶上。脂类和多糖除去脂类和多糖除去：都可以通过超速
14、离心。：都可以通过超速离心。去盐方法：去盐方法：透析可以降低盐浓度，但时间太长；也透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。蛋白质的部分损失。1.2.样品制备方法样品制备方法1.2.1.培养动物细胞样品处理方法培养动物细胞样品处理方法：培养动物细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收培养动物细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋）抽提总蛋白。白。裂解缓冲液裂解缓冲液有多种配方，如：有多种配方，如：A.7M urea，
15、2M Thiourea，4（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2 Pharmalyte pH 3-10.B.9.5M urea,2%(w/v)CHAPS,0.8%(w/v)Phamarlyte pH3-10,1%(w/v)DTT and 5mM proteinase inhibitor;C.总蛋白抽提程序总蛋白抽提程序培养细胞的收集；培养细胞的收集；用磷酸缓冲液（用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞）洗细胞 3 次（室温，次（室温，1000g，各，各2min）；）；将细胞分装到将细胞分装到 1.5ml Eppendof管中，吸干残留的管中，吸干残留的 PBS；加入裂解
16、缓冲液加入裂解缓冲液(1.5x10个细胞大约加入个细胞大约加入 100L 裂解液裂解液)，在室温振荡，在室温振荡1h，使其充分溶解；，使其充分溶解；4，40,000g，离心，离心1h；吸取上清并用吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白，然后分装法定量蛋白，然后分装至至 Eppendof 管里保存在管里保存在-70备用。备用。提取水溶性蛋白提取水溶性蛋白裂解液配方裂解液配方40 mM Tris-base(pH 9.5)in ultrapure H2O 提取膜蛋白裂解液配方提取膜蛋白裂解液配方 5 M urea,2 M thiourea,2%SB 3-10（一种去污剂）,2%CHAPS,1%
17、w/v DTT,0.5%CA（儿茶酚胺）and a cocktail of protease inhibitors1.2.2.组织样品处理方法组织样品处理方法 对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序，但遵循的原而言，同样没有一种通用的程序，但遵循的原则基本相同。则基本相同。(1).三氯醋酸三氯醋酸/丙酮沉淀法提取树叶总蛋白丙酮沉淀法提取树叶总蛋白下面列出一种利用下面列出一种利用三氯醋酸丙酮沉淀法三氯醋酸丙酮沉淀法提取植物树叶总蛋提取植物树叶总蛋白的方法。白的方法。在液氮中研碎叶片；在液氮中研碎叶片；悬浮于含悬浮于含 10三氯醋酸
18、（三氯醋酸（TCA）和）和 0.07%-巯基乙醇巯基乙醇 (可用可用DTT替代替代)的丙酮溶液在的丙酮溶液在-20 的冰浴；的冰浴；让蛋白质沉淀过夜然后离心让蛋白质沉淀过夜然后离心(4,40,000g,1h)，弃上清；，弃上清；重悬沉淀浮于含重悬沉淀浮于含 0.7-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液；巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液；离心离心(4，40,000g,1h)后真空干燥沉淀；后真空干燥沉淀；用用(A)或或(B)裂解液溶解沉淀，离心裂解液溶解沉淀，离心(4，40,000g,1h)。Brandford 法定量蛋白，然后分装至法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里保存管里保存 在在-70备用。备用。
19、(2).植物根叶材料蛋白质样品提取植物根叶材料蛋白质样品提取提取方法一：提取方法一：1.12 g 材料剪碎后加入材料剪碎后加入10mg PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮，吸附色素吸附色素)及少量及少量石英砂，用液氮研磨成粉。石英砂，用液氮研磨成粉。2.加入加入10 ml 含含10%三氯乙酸三氯乙酸(TCA)、10mM 即即0.07%-巯基乙醇的丙酮，巯基乙醇的丙酮，混匀，混匀，-20沉淀沉淀1 小时。小时。3.4下，下，15000 r/min离心离心15 min，弃上清。，弃上清。4.沉淀复溶于沉淀复溶于10ml冷丙酮冷丙酮(含含10 mM-巯基乙醇巯基乙醇)，再于，再于-20沉淀
20、沉淀1小时。小时。5.同上离心弃上清（可用含同上离心弃上清（可用含10 mM-巯基乙醇的巯基乙醇的80丙酮再处理一次丙酮再处理一次)。6.所得沉淀低温冷冻真空抽干。所得沉淀低温冷冻真空抽干。7.按每按每mg干粉加入干粉加入20l（可调）（可调）蛋白裂解液蛋白裂解液9.5 M尿素，尿素，5mM 碳酸钾，碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇二硫苏糖醇)，2%Ampholine(pH3.5-10)，6%Triton X-100，37育育30min，期间搅动几次。，期间搅动几次。8.28（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心离
21、心15 min，离心力越大时间长一点越好！离心力越大时间长一点越好！9.上清即可上样电泳或者上清即可上样电泳或者-70度保存度保存山黧豆叶片蛋白质不同提取方法的效果比较山黧豆叶片蛋白质不同提取方法的效果比较见：见：吴庆丰等，吴庆丰等，2006,26(7):1330-13361.直接提取法直接提取法:取山黧豆叶片取山黧豆叶片300 mg，液氮研磨，加，液氮研磨，加 30 mgPVP，悬浮于，悬浮于 900uL的蛋白质的蛋白质提取液提取液中中(50mmol/L Tris-HCl pH 6.8，0.5%SDS，10%甘油，甘油，5%-巯巯基乙醇基乙醇)中，中，4 浸提浸提 60 min，然后离心，然
22、后离心(13 000 r/min，4，15 min)，取上清，取上清、分装、分装、电泳或冻存、电泳或冻存于于-70。山黧豆叶片蛋白质不同提取方法的效果比较山黧豆叶片蛋白质不同提取方法的效果比较2.丙酮沉淀法丙酮沉淀法 取山黧豆叶片取山黧豆叶片 300 mg，液氮研磨，加，液氮研磨，加 30 mgPVP，悬浮于悬浮于 900uL 的蛋白质提取液的蛋白质提取液(同方法同方法 1)中，中，4浸提浸提 60 min，离，离 心心(13 000 rmin，4，15 min)，取上清。，取上清。加入加入 3倍体积冷丙酮倍体积冷丙酮(含含 0.07%-巯巯 基乙醇基乙醇)后混后混匀，匀，-20沉淀蛋白质沉淀
23、蛋白质 1 h或过或过 夜，离夜，离 心心(15300 r/min，4 ，1min)去上清，沉去上清，沉 淀用淀用 80%、100%冷丙酮各冷丙酮各洗洗 1次次,-20放置放置，挥发丙酮后获得蛋，挥发丙酮后获得蛋 白质干粉白质干粉，小，小 量分装量分装，冻存于，冻存于-70。结果比较结果比较将上述三种方法获得的蛋白质进行将上述三种方法获得的蛋白质进行 SDS-PAGE分析，电泳分析，电泳结果发现：结果发现：直接提取法直接提取法的电泳图谱中条带较少且比较模糊的电泳图谱中条带较少且比较模糊，说明样，说明样 品中影响电泳的盐离子浓度较高或蛋白质有所品中影响电泳的盐离子浓度较高或蛋白质有所 降解。降解
24、。丙酮沉淀法丙酮沉淀法 和和 TCA-丙酮沉淀法丙酮沉淀法 的电泳效果较好，条带较的电泳效果较好，条带较多并且清晰多并且清晰。在这两种方法中丙酮沉淀法相对在这两种方法中丙酮沉淀法相对 TCA-丙酮沉淀法技术程丙酮沉淀法技术程序复杂。序复杂。结论：结论：TCA-丙酮沉淀法步骤简单、蛋白质提取量多、电丙酮沉淀法步骤简单、蛋白质提取量多、电泳效果好。泳效果好。(3).超速离心法超速离心法取材；取材；用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样样品加入品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s；组织悬液组织悬液15，10 00
25、0g离心离心10 min；上清液上清液4，150 000g超速离心超速离心45 min；小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清,6 40,000g再次离心再次离心50 min；取离心上清。取离心上清。Bradford法定量，分装后置法定量，分装后置70保保存。存。(4).细菌蛋白质样品制备方法细菌蛋白质样品制备方法1.细菌菌株用合适的培养基，如细菌菌株用合适的培养基，如LB、NA 等液体培养基于等液体培养基于 30 C下振荡培养至稳定生长前期下振荡培养至稳定生长前期2.菌液离心后用菌液离心后用 10 mmol/L 的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液(pH7.0)漂洗
26、两漂洗两次，离心后保存于次，离心后保存于-80的低温冰箱中的低温冰箱中 3.冷冻的细胞用超声波直接在冷冻的细胞用超声波直接在裂解液裂解液(8 mol/L Urea，4%w/v CHAPS，1%w/v DTT，2%v/v Ampholine，pH 3.510)中超声破碎，样品在冰上采用中超声破碎，样品在冰上采用 1/2间隔超声间隔超声 9 min。离心。离心(12000rpm，20 min)后取上清液，分装后保后取上清液，分装后保存在存在-80的低温冰箱中的低温冰箱中4.用用 Bradford法测定蛋白质浓度。法测定蛋白质浓度。产碱假单胞菌全蛋白提取产碱假单胞菌全蛋白提取1.细菌培养物在细菌培养
27、物在4，10,000r离心离心10min，沉淀用，沉淀用40mM/L Tris溶液洗涤溶液洗涤2次，细胞在离心管中重悬于次，细胞在离心管中重悬于40mM/L Tris中，中，至至0.5gmL.2.超声波粉碎超声波粉碎(乙醇乙醇-冰混合物中进行，超声波条件：持续冰混合物中进行，超声波条件：持续 10s，20s间隔，共间隔，共 10min)3.样品随后加入样品随后加入 DNA-RNA酶处理酶处理(终浓度终浓度 lmg DNA 酶酶/mL，5mg RNA酶酶/mL，1mM MgC12)于室温静置于室温静置20min，然，然后于后于 15，12,000g离心离心 8min。4.收集上清液置于收集上清液
28、置于 50mL离心管中，加入冷甲醇至离心管中，加入冷甲醇至40mL，-80 存放存放 1h以沉淀蛋白质以沉淀蛋白质5.4 ，12000g再次离心再次离心 30min，小心弃去上清液，沉淀用，小心弃去上清液，沉淀用0.5mL稀释液溶解稀释液溶解(8molL尿素尿素,4CHAPS溶于溶于40mM/L Tris)2.第一向等电聚焦（第一向等电聚焦（IEF）2.1.凝胶制备凝胶制备2.1.1.玻璃管的处理玻璃管的处理:先用先用2M 的的NaOH 泡至少泡至少 1hr，用自来水冲后，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换，中间至少换2，3 次水次水;后用后用
29、2M的的HCl 泡至少泡至少1 个小时，用双蒸水冲，个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1 个小时，个小时，中间换中间换3，4 次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇里面里面1hr，烘干就可以用了，烘干就可以用了.干净玻管干净玻管(18cm1.5mm)用用Parafilm封口膜封好封口膜封好底部，在底部，在16cm处作好标记处作好标记,垂直放在泡沫板上。垂直放在泡沫板上。2.1.2.灌灌IEF的配方的配方6.0 g 尿素5.4 ml 水2.0 ml 30%凝胶(ACR 28.38，BIS 1.62)48 ul
30、 Ampholyte solution 3.5-10 240 ul Ampholyte solution 3.5-10 -25 ul 10%AP 20 ul TEMED2.1.3.2.1.3.制胶过程制胶过程用注射器吸好胶液，装上用注射器吸好胶液，装上7号针头，将号针头，将7号号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当小时以上，适当长一点的时间好一些。长一点的时间好一些。2.2.加样与电泳加样与电泳 待胶聚合
31、好后，除去待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，并吸去顶部的覆盖液，加样加样80g，上面再小心加入，上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口至管口,不不要破坏样品与要破坏样品与NaOH 的界面。即可进行电泳。的界面。即可进行电泳。电极液为：上槽（负极）为电极液为：上槽（负极）为50m mol/L NaOH 液，下液，下槽（正极）为槽（正极）为25m mol/L H3PO4。按按200V15min，300V30min，400V18h，1000V1 h的程序进行电聚焦。的程序进行电聚焦。或者直接或者直接400V 17hr 1000V 2hr。应特别注意的是跑第一应特别注意的
32、是跑第一向一定要在保持在向一定要在保持在37左右。左右。2.3.电泳后的凝条处理电泳后的凝条处理1.电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200l的枪的枪头，当然枪头与注射器间用头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。部向下注水使胶条向下滑出。注意注意：注射器、枪头、玻璃管必须为一直线，注意不：注射器、枪头、玻璃管必须为一直线，注意不要把注射器的头搞断了。要把注射器的头搞断了。2.取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成切成0.5cm 的小段，
33、各自浸入含的小段，各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的pH值，以凝胶长度为横坐标，值，以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标作图，即值为纵坐标作图，即为等电点标准曲线。为等电点标准曲线。3.把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在可长期保存在4冰箱中4.用ddH2O浸泡30min,而且要换至少5 次水,每次用不同的小平皿。先用12%的TCA 浸泡，观察条带。如看不见条带,再把用水浸泡，观察条带。5.对要进行第二向SDS-PAGE 的胶条用平衡液2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HC
34、L（pH6.8），10%甘油，5%巯基乙醇，0.1%溴酚蓝进行二次平衡，第一次20min，第二次25min。第2 次的溶液为新的。平衡过程中每隔几分钟轻轻的晃一下小平皿。利用利用IPGphor仪仪进行第一向等电聚焦（进行第一向等电聚焦（IEF）双向电泳的第一向双向电泳的第一向 IEF 电泳采用电泳采用 IPGphor，实验将，实验将变得很简单。变得很简单。IPGphor 包括半导体温控系统包括半导体温控系统(18-25)和程序化电源和程序化电源(8000V，1.5mA)。可采用普通型胶条槽一。可采用普通型胶条槽一步步 完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。完成胶条的水化、上样和电泳，大
35、大减少操作步骤。IPGphor 一次可进行一次可进行 12 个胶条槽的电泳个胶条槽的电泳(7,11,13，18，24cm)，因采用高电压，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。最，可缩短聚焦时间。最新推出新推出 的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的电极，适合任何长度的 IPG胶条，尤其适合极性等电点胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。蛋白的分离。IPGphor仪仪一、一、IPG 胶条的水化和电泳胶条的水化和电泳 1.试剂：水化液（水化液（8M 尿素，尿素，2%CHAPS，15mM DTT 和和 0.5%IPG 缓冲液）缓
36、冲液）:水化液需当天新鲜配制水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装可配成储液分装-20 度保度保存，但不可反复冻融存，但不可反复冻融)。尿素溶液加热温度不能超过尿素溶液加热温度不能超过 37 ，否则蛋白会，否则蛋白会发生氨甲酰化。发生氨甲酰化。2.实验步骤实验步骤(1).加样品水化加样品水化 用样品溶解缓冲液用样品溶解缓冲液(9M 尿素，尿素，4%CHAPS，2%IPG 缓冲缓冲液，液，40mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品溶解样品。蛋白质上样。蛋白质上样浓度不要超过浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。吸取适量含有样品的水化
37、液放入标准型胶条槽中，为确吸取适量含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。从酸性端（尖端）一侧剥去从酸性端（尖端）一侧剥去 IPG 胶条的保护膜，胶面朝胶条的保护膜，胶面朝下，先将下，先将 IPG胶条尖端胶条尖端(阳性端阳性端)朝标准型胶条槽的尖端朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下生成气泡，最后放下 IPG胶条平端胶条平端(阴极阴极)，使水化液浸，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。湿
38、整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。2.实验步骤实验步骤IPG 胶条上覆盖适量胶条上覆盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油，盖覆盖油，盖上盖子。上盖子。将标准型胶条槽的尖端背面电极与将标准型胶条槽的尖端背面电极与 IPGphor 仪器的阳仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器仪器的阴极平台接触。的阴极平台接触。设置设置 IPGphor 仪器运行参数：仪器运行参数：IPG胶条水化的电压，胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度.IPG 胶条水化后可
39、自动进行等电聚焦电泳。胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。暂时不进行第二向的暂时不进行第二向的 IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中胶条可夹在两层塑料薄膜中于于-80 保存几个月。保存几个月。电泳条件电泳条件(2).不加样品水化不加样品水化 标准型胶条槽：标准型胶条槽：用适量的水化液进行胶条水化，方法同上步骤用适量的水化液进行胶条水化，方法同上步骤 3-5，水化，水化过夜。过夜。于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。每个加样孔的一侧于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。每个加样孔的一侧可加入可加入 7.5l样品样品(每个加样孔分别有两侧可加样每个加样孔分别有两侧可加样)，采用此，采用此种方法上样，每个胶条槽最
40、多可加入种方法上样，每个胶条槽最多可加入 30l 样品。样品。设置设置 IPGphor 仪器运行参数仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度，和温度，进行等电聚焦电泳。进行等电聚焦电泳。暂时不进行第二向的暂时不进行第二向的 IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80 保存几个月。保存几个月。(2).不加样品水化不加样品水化通用型杯上样胶条槽通用型杯上样胶条槽采用采用 Immobiline DryStrip 水化盘或标准型胶条槽进行水化盘或标准型胶条槽进行 IPG 胶条的水化，加入适量的胶条的水化，加入适量的 水化液进行胶条水化，方法同上水化液
41、进行胶条水化，方法同上步骤步骤 3-4，水化过夜。，水化过夜。将通用型杯上样胶条槽的尖端与将通用型杯上样胶条槽的尖端与 IPGphor 仪器的阳极平台仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端与接触；胶条槽的平端与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。仪器的阴极平台接触。将已水化的将已水化的 IPG 胶条转移到通用型杯上样胶条槽。胶面朝胶条转移到通用型杯上样胶条槽。胶面朝上，先将上，先将 IPG胶条尖端胶条尖端(阳性端阳性端)朝胶条槽的尖端方向放入朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，胶条必需横跨胶条槽的与胶条槽中，胶条必需横跨胶条槽的与 IPGphor 仪器的两个仪器的两个电极板接触的区域。电极板接触的区域
42、。在在 IPG胶条表面上盖适量胶条表面上盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油覆盖油(3-5ml)，充满整个胶条槽，充满整个胶条槽。(2).不加样品水化不加样品水化取两个取两个 IEF 电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除多余的水。多余的水。分别将两个分别将两个 IEF 电极片放在电极片放在 IPG 胶条胶的两端，分别将胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。电极压在两个电极片的外缘。品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的于碱性分离范围的 IPG胶条，
43、尽量将样品杯靠近阳极放置。胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置。在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。样前吸走水化液。上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样 100l。盖上胶条槽的盖子，再盖盖上胶条槽的盖子，再盖 IPGphor 仪器的盖子。仪器的盖子。k 设置设置 IPGphor 仪器运行参数仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。压和温度。二、二、IPG胶条的平衡胶条的平衡IPG胶条平衡两次，每次胶条平衡两次，每次 15 分钟。平衡
44、缓冲液包括分钟。平衡缓冲液包括 6 M 尿素和尿素和 30%甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第二向的转移。第一步平衡第一步平衡在平衡液中加入在平衡液中加入 DTT，使变性的非烷基化的，使变性的非烷基化的蛋白处于蛋白处于 还原状态；还原状态；第二步平衡第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的 DTT 烷基化烷基化(银染过程中，银染过程中，DTT 会导致点拖尾会导致点拖尾point str
45、eaking)。将。将 IPG胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向液，然后放入第二向 SDS 胶中。胶中。1 试剂试剂u4x 分离胶缓冲液分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl,pH8.8 和和 0.4%(w/v)SDS)：45.5g Tris 和和 1g SDS 溶于溶于 200ml 去离子水中，用去离子水中，用 6N HCl调节调节 pH 到到 8.8，最后用去离子水将体积补足到，最后用去离子水将体积补足到 250ml，加入，加入 25mg 叠氮钠并过滤。此溶液可于叠氮钠并过滤。此溶液可于 4储存两储存两周。周。u平衡缓冲液平衡缓冲液(0
46、.05 M Tris-HCl,pH 8.8，6 M 尿素尿素,30%(w/v)甘油和甘油和 2%(w/v)SDS)：180 g 尿素尿素,150 g 甘油甘油,10 g SDS 和和 16.7 ml 分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将体分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将体积补足到积补足到 500ml。此种缓冲液可于室温下保存两周。此种缓冲液可于室温下保存两周。u溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液:0.25%(w/v)溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中25 mg 溴酚蓝溶于溴酚蓝溶于 10 ml 分离胶缓冲液中，分离胶缓冲液中，4 储存储存。2.实验步骤实验步骤 使用前每使用前每 10ml 平衡
47、缓冲液中加入平衡缓冲液中加入 100mg DTT(相当于平衡缓冲液相当于平衡缓冲液 I).根据下表加根据下表加入适量平衡缓冲液入适量平衡缓冲液 I 和溴酚蓝溶液。取出和溴酚蓝溶液。取出 IPG胶条分别放入玻璃管中胶条分别放入玻璃管中(支持膜贴着支持膜贴着管壁，每个玻璃管中放入一条管壁，每个玻璃管中放入一条 IPG 胶条胶条)，用，用Parafilm 封口，在振荡仪上振荡封口，在振荡仪上振荡 15 分钟，倒掉平衡缓冲液分钟，倒掉平衡缓冲液 I。IPG 胶条平衡液用量胶条平衡液用量胶条长度胶条长度(cm)建议平衡液体积建议平衡液体积(ml)/条条溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液(l)72.5-512.5-25
48、 115-10 25-50 135-1025-50 1810 50 241570 2.实验步骤（续）实验步骤（续）每每 10ml 平衡缓冲液加入平衡缓冲液加入 400mg 碘乙酰胺碘乙酰胺(相当于平衡缓冲液相当于平衡缓冲液 II)。根据上表加入适。根据上表加入适量平衡缓冲液量平衡缓冲液 II 和溴酚蓝溶液。用和溴酚蓝溶液。用 Parafilm 封口，在振荡仪上振荡封口，在振荡仪上振荡 15 分钟，分钟，倒掉平衡缓冲液倒掉平衡缓冲液 II。用去离子水润洗用去离子水润洗 IPG 胶条一秒钟，将胶胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。的
49、平衡缓冲液。IPG 胶条的转移：将 IPG 胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将 IPG胶条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在 IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。加入分子量标准蛋白：分子量标准蛋白溶液与等体积的 1%琼脂糖溶液混合后，加入到 IEF上样纸片上或直接加入到 IEF 上样滤纸片上。用镊子将上样滤纸片放置在 IPG胶条末端一侧。最后用琼脂糖密封液进行封顶，用少量的密封液（约 1-1.5ml)使 IPG胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡。3.第二向第二向 SDS电泳电泳 -垂直垂直 SDS
50、-PAGE SDS-PAGE 根据第一向根据第一向 IEF 电泳时电泳时 IPG 胶条的大小选择第二胶条的大小选择第二向合适的垂直电泳槽。最新推出的向合适的垂直电泳槽。最新推出的 Ettan DALT II 是是为大规模、高通量、高重复性双向电泳第二向为大规模、高通量、高重复性双向电泳第二向SDS-PAGE 专门设计的。专门设计的。同时进行同时进行 12 块块 26 x 20cm板胶电板胶电泳，适于长至泳，适于长至24cmIPG 胶条。其灌胶模具每次最多胶条。其灌胶模具每次最多可可 灌制灌制 14 块胶。块胶。通常不需要浓缩胶。通常不需要浓缩胶。灌胶灌胶步骤步骤按仪器说明书装好灌胶模具，倒入凝