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1、第8章微生物污染及其检测技术 微生物与环境污染 水体中的病原微生物 表10-1通过粪便进入水体的病原体细细菌菌病毒病毒其他其他*沙沙门门氏菌属氏菌属脊随灰脊随灰质质炎病毒炎病毒溶溶组织组织内阿米巴内阿米巴志志贺贺氏菌属氏菌属考克考克赛赛基病毒基病毒结肠结肠小袋虫小袋虫致病性大致病性大肠肠杆菌杆菌肠细肠细菌病菌病变变人孤儿病毒人孤儿病毒人等人等孢孢子球虫子球虫变变形杆菌属形杆菌属呼呼肠肠孤病毒孤病毒兰兰伯氏伯氏贾贾弟虫弟虫克雷伯氏杆菌属克雷伯氏杆菌属腺病毒腺病毒日本血吸虫日本血吸虫土拉土拉热热弗朗西弗朗西丝丝氏菌氏菌轮轮状病毒状病毒钩钩虫虫假假单单胞杆菌属胞杆菌属肝炎病毒肝炎病毒蛔虫蛔虫沙雷氏杆
2、菌属沙雷氏杆菌属胃胃肠肠炎病毒炎病毒小小肠结肠肠结肠炎耶炎耶尔尔森氏菌森氏菌以虫卵、包裹、幼虫等形式以虫卵、包裹、幼虫等形式进进入入水体水体空空肠肠弯曲杆菌弯曲杆菌霍乱弧菌霍乱弧菌水体中的主要病原微生物类群水体中的主要病原微生物类群 沙门氏菌属沙门氏菌属(Salmonella）志贺氏菌属志贺氏菌属(Shigella）霍乱弧菌霍乱弧菌(Vibriocholerae)肠道病毒属肠道病毒属(Enterovirus)甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus）Salmonella typhimurium(red)invadingculturedhumancellsLT2A-SL1344g
3、enomeShigella sonne的部分特性的部分特性Shigella typhimurium 微生物代谢物与环境污染微生物代谢物与环境污染 氨氨硝酸与亚硝酸硝酸与亚硝酸氮氧化物氮氧化物硫化氢硫化氢酸性矿水酸性矿水甲基汞甲基汞农药代谢的毒性产物农药代谢的毒性产物细菌毒素细菌毒素肉毒毒素肉毒毒素(botulin)葡萄球菌肠毒素葡萄球菌肠毒素放线菌毒素放线菌毒素放线菌素放线菌素链脲菌素链脲菌素洋橄榄霉素洋橄榄霉素真菌毒素真菌毒素以黄曲霉毒素以黄曲霉毒素为为例例剧毒剧毒,黄曲霉黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生和寄生曲霉曲霉(Asp.parasiticus)产产生生紫外紫外线线
4、照射下可照射下可发发出出荧荧光光B族和族和G族，族，蓝蓝色色荧荧光和光和绿绿色色荧荧光光已确定已确定结结构的黄曲霉毒素有构的黄曲霉毒素有17种，种，其中以黄曲霉毒素其中以黄曲霉毒素1毒性最大，毒性最大，致癌力最致癌力最强强。藻类毒素藻类毒素甲藻甲藻蓝细菌毒素蓝细菌毒素:微囊藻快速致死因子微囊藻快速致死因子(MicrocystisFDF)第一章第一章 环境监测中的微生物学方法环境监测中的微生物学方法当环境受到污染后，环境的物理性质、当环境受到污染后，环境的物理性质、化学性质和生物学特性化学性质和生物学特性发生变化发生变化,如：如：重金属离子、重金属离子、NO3-浓度增加；浓度增加；水体污染变质，
5、水生生物种类减少，甚水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝。至灭绝。如何监测？如何监测？v化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但为瞬时值；为瞬时值；v生物学方法：利用生物学方法：利用生物种类生物种类、数量的变化数量的变化，生物生物学特性的改变学特性的改变来监测污染物对环境的影响。来监测污染物对环境的影响。v生物学方法的特点：可监测到污染物对环境的综合影生物学方法的特点：可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。一、空气微生物来源一、空气微生物来源空气并非微生物的繁殖场所，空
6、气中缺乏水分空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。土壤中飞扬起来的灰尘；土壤中飞扬起来的灰尘；水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传播。播。第一节第一节 空气的卫生学检验空气的卫生学检验微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空气中，形成气中，形成“气溶胶气溶胶”，借风力传播。，借风力传播。空气中的微生物中，真菌的孢子数量最空气中的微生物中，真菌的孢子数量最多，细
7、菌较少。而且藻类、酵母菌、病多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病毒都会存在于空气中毒都会存在于空气中。InfectionTransfer-AirborneDropletNuclei二、空气微生物的卫生标准二、空气微生物的卫生标准目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，一般以室内一般以室内1m3空气中细菌总数为空气中细菌总数为501,000个以上作为空气污染的指标。个以上作为空气污染的指标。病原菌在空气中易死亡，但病原菌在空气中易死亡，但结核菌、白结核菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎菌、
8、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎病毒等病毒等，也可以在空气中存活一段时间。，也可以在空气中存活一段时间。尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医院、城市街道的空气中，微生物数量较院、城市街道的空气中，微生物数量较多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和高纬度地带的空气中，微生物较少。高纬度地带的空气中，微生物较少。场所场所畜舍畜舍宿舍宿舍城市城市街道街道市区市区公园公园海洋海洋上空上空北纬北纬80微生物微生物(12)106 2104 55103200120表表2-1不同场所上空微生物的数量（个不同场所上空微生物的数量（个/m3）表表2-2以
9、细菌总数评价空气的卫生标准（个以细菌总数评价空气的卫生标准（个/m3）清洁程度清洁程度细菌总数细菌总数最清洁的空气（有空调）最清洁的空气（有空调）12清洁空气清洁空气30普通空气普通空气31125临界环境临界环境150轻度污染轻度污染301三、空气的微生物监测三、空气的微生物监测采用营养琼脂平板计数法。培养皿直径为d90mm和d100mm。评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生物数量和空气污染微生物。细菌指标：细菌总数和绿色链球菌必要时测定病原微生物。(一一)空气微生物测定空气微生物测定 1 1固体法固体法平皿落菌法平皿落菌法(沉降沉降平板法平板法)、撞击法撞击法(缝隙采样器、筛板采样器、针
10、孔采样器缝隙采样器、筛板采样器、针孔采样器)过滤法。过滤法。(1)(1)平皿落菌法平皿落菌法培养基融化倒入培养基融化倒入d90mm无菌平皿制成平板无菌平皿制成平板,置于待测点置于待测点(通常通常5个个)，打开皿盖暴露于空气打开皿盖暴露于空气510min，盖好皿盖，盖好皿盖，30培养培养48h；计菌落数。计菌落数。通过奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。通过奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。奥氏假设：奥氏假设：5min内落在面积内落在面积100mm2营养营养琼脂平板上的细菌数和琼脂平板上的细菌数和10L空气中所含的空气中所含的细菌数相同。细菌数相同。奥氏公式：奥氏公式：式中：式中：C空气细菌数；空气细
11、菌数；A捕集面积，捕集面积，cm2；t暴露时间，暴露时间，min；N菌落数，个。菌落数，个。5t100A100010NC=简化后：简化后：奥式公式计算的浮游细菌数比实测数少。奥式公式计算的浮游细菌数比实测数少。没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流，人员密没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流，人员密度和活动情况。度和活动情况。C=100050NAt(2)撞击法：撞击法：v以缝隙采样器为例，以缝隙采样器为例，用真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝用真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝（宽度有（宽度有0.15mm、0.33mm和和1mm三种三种)抽抽吸到营养琼脂培养基平板上。吸到营养琼脂培养基平板上。狭缝长度为
12、平皿半径，平板与缝间距狭缝长度为平皿半径，平板与缝间距2mm，平板转速平板转速:1r/min、5-60r/min、60r/min。根据空气中微生物密度调节平板转动的速度根据空气中微生物密度调节平板转动的速度含菌高，转动快；含菌低，转动慢。含菌高，转动快；含菌低，转动慢。由取样时间和空气流量计算单位空气含菌量。由取样时间和空气流量计算单位空气含菌量。采样器的规格各国不一，操作有差异。采样器的规格各国不一，操作有差异。培养前培养后撞击法检测空气中微生物数量撞击法检测空气中微生物数量2、液体法、液体法测定空气中悬浮微生物，主要细菌测定空气中悬浮微生物，主要细菌将将一一定定体体积积的的含含菌菌空空气气
13、通通入入无无菌菌蒸蒸馏馏水水，使使微生物均匀分布在水中，微生物均匀分布在水中，取取一一定定量量菌菌液液于于无无菌菌培培养养皿皿中中，倒倒入入15-18ml融化的培养基，混匀、冷凝成平板，融化的培养基，混匀、冷凝成平板，37培养培养48h，计菌落数计菌落数。以以菌菌液液体体积积和和通通入入空空气气量量计计算算出出单单位位体体积积空空气中的细菌数量。气中的细菌数量。例如：例如：l10m3含含菌菌空空气气通通入入100mL的的无无菌菌水水，微微生物全部截留在水中。生物全部截留在水中。l取取0.1mL菌液涂布于平板上，菌液涂布于平板上，长长出出100个个菌菌落落，则则10mL水水中中含含菌菌10,00
14、0个个，10m3空气含有空气含有10,000个。个。1m3空气含有空气含有1,000个个。(二二)空气微生物的检测点数空气微生物的检测点数空气微生物的测点数越多越准确，为照顾空气微生物的测点数越多越准确，为照顾到工作方便，又相对准确，以到工作方便，又相对准确，以2030个测点个测点数为宜，最少测点数为数为宜，最少测点数为56，见表。，见表。时时间间标准标准名称名称最少最少测点测点数数建议建议测点测点数数点距点距（m）每点每点测定测定次数次数1987JISB9920洁净室中浮洁净室中浮游粒子游粒子测定方法和测定方法和洁净室的评洁净室的评价方法价方法620，30原则原则上上3空间太空间太大大可放可
15、放宽宽31987空气清空气清净协净协会标准会标准洁净室性能洁净室性能评价指南评价指南520,30原则原则上上3表表1日本有关标准测点数的规定日本有关标准测点数的规定摘自许钟麟空气洁净技术原理P522同济大学出版社，1998表表2 2 按美国联邦标准按美国联邦标准209E209E方法计算的必要测点数方法计算的必要测点数 洁洁净净度度进风面积进风面积(单向流单向流)或室面积或室面积(乱流乱流)m2100级及级及高于高于100级级1000级级10000级级100000级级10102040801002004002348163240801602361325326312622248102040222223
16、613表3浮游菌最小采样量浮游菌上限浓度浮游菌上限浓度个个m-2min-1计算最小采样量计算最小采样量m310510.50.10.050.30.6363060表表表表4 4 4 4 落菌法测细菌所需要的最落菌法测细菌所需要的最落菌法测细菌所需要的最落菌法测细菌所需要的最少培养皿数少培养皿数少培养皿数少培养皿数(沉降沉降沉降沉降0.5h)0.5h)0.5h)0.5h)含尘浓度最大值含尘浓度最大值需要需要d90mm培养皿数培养皿数0.353.5353503500350004013421第二节第二节 水质的细菌学检验水质的细菌学检验一、一、细菌总数细菌总数将将定量水样定量水样（原水样或稀释水样（原水
17、样或稀释水样1mL）接种）接种于于牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板琼脂培养基平板37C培养培养24hr后观察结果，计后观察结果，计菌落数菌落数，计算原水样每毫升的细菌总数。计算原水样每毫升的细菌总数。u具有相对的具有相对的卫生学意义卫生学意义：菌数越高，水体受有机物污染或粪便污染越菌数越高，水体受有机物污染或粪便污染越重，病原菌污染的可能性亦大重，病原菌污染的可能性亦大（为什么？）（为什么？）。二、粪便污染指示菌二、粪便污染指示菌人畜粪便中常常带有大量的微生物，水质的卫生人畜粪便中常常带有大量的微生物，水质的卫生学检验，对于保护人群健康，具有重要意义学检验，对于保护人群健康，具有重要意义
18、有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染，从而引发各种肠道疾病。染，从而引发各种肠道疾病。致病菌数量少，直接检测复杂，选用间接指标即致病菌数量少，直接检测复杂，选用间接指标即粪便污染指示菌为代表。粪便污染指示菌为代表。以肠道正常细菌在水中的存在及数量作为粪便污染的以肠道正常细菌在水中的存在及数量作为粪便污染的指示。指示。健康成人粪便内的微生物数量健康成人粪便内的微生物数量健康成人粪便内的微生物数量健康成人粪便内的微生物数量微生物名称微生物名称每克粪便中平均生长菌
19、落数每克粪便中平均生长菌落数主要微生物拟杆菌属1010乳酸杆菌属109大肠埃希氏菌属108粪链球菌108次要的微生物柠檬酸杆菌属105-106梭菌属105-106葡萄球菌属105-106克雷伯氏菌属104-105肠杆菌属104-105芽孢杆菌属酵母属104-105霉菌104-105较少的微生物变形菌属102-103铜绿假单胞菌属102-103（一）指示菌的理想条件（一）指示菌的理想条件1.大量存在于人的粪便，数量比病原菌多；大量存在于人的粪便，数量比病原菌多；2.受粪便污染的水中易检测出，未受污染的受粪便污染的水中易检测出，未受污染的水中无检测；水中无检测；3.在水体中不会自行繁殖；在水体中不
20、会自行繁殖；4.存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗略强于致病菌；略强于致病菌；5.检出及鉴定方法比较简易迅速；检出及鉴定方法比较简易迅速；6.适用于各种水体。适用于各种水体。（二）适宜的指示菌（二）适宜的指示菌总大肠菌群，总大肠菌群，粪大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌）大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌）克雷伯氏菌属。克雷伯氏菌属。三、大肠杆菌三、大肠杆菌（一）特征（一）特征大肠杆菌定义：大肠杆菌定义：v一群一群需氧或兼性厌氧性需氧或兼性厌氧性的的G-无芽孢杆菌无芽孢杆菌，37C培培养养24hr，能发酵乳糖产酸产气。包括了粪便内全，能发酵乳糖产酸产
21、气。包括了粪便内全部兼性需氧性部兼性需氧性G-杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为主，以及柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌主，以及柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。属等。成人粪便排出菌数可达成人粪便排出菌数可达(5100)106cfu/d。（二）大肠菌群的测定（二）大肠菌群的测定常用多管发酵法或滤膜法。常用多管发酵法或滤膜法。1.发酵法：发酵法：又称又称多管发酵法或三步发酵法多管发酵法或三步发酵法1)初发酵（推测试验）初发酵（推测试验）将不同稀释度的水样，分别接种于含乳将不同稀释度的水样，分别接种于含乳糖等糖类的培养液糖等糖类的培养液(3倍或倍或1倍乳糖液倍乳糖液)
22、,37C培养培养24hr，观察产酸产气情况，观察产酸产气情况，初步判断是否有大肠菌群存在。初步判断是否有大肠菌群存在。2）平皿分离（证实试验）平皿分离（证实试验）水中其它细菌有可能引起糖类发酵，因此需要水中其它细菌有可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。进一步证实。初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基或远藤氏培养基上，基或远藤氏培养基上，37C培养培养24hr，根据菌落特征，挑取大肠菌群疑似菌落制片，根据菌落特征，挑取大肠菌群疑似菌落制片，革兰氏染色证实是否为大肠菌群。革兰氏染色证实是否为大肠菌群。3）复发酵试验（完成试验）复发酵试验（完成试验）将
23、大肠菌群疑似菌落再次接入将大肠菌群疑似菌落再次接入1倍乳糖液，倍乳糖液，37C培养培养24hr，产酸产气者即确证为大，产酸产气者即确证为大肠菌群。肠菌群。结果计算结果计算产酸、产气记为阳性反应，产酸、产气记为阳性反应，不产酸、不产气记为阴性反应。不产酸、不产气记为阴性反应。根据阳性管数量，查表计算水体大肠菌群数量。根据阳性管数量，查表计算水体大肠菌群数量。2 2 滤膜法滤膜法发酵法检测需要时间较长，为缩短时间，发酵法检测需要时间较长，为缩短时间，可以采用滤膜法，其步骤为：可以采用滤膜法，其步骤为：1）水样过滤：）水样过滤：选用微孔滤膜，灭菌后抽滤选用微孔滤膜，灭菌后抽滤一定量的待测水样，将水中
24、的细菌截留一定量的待测水样，将水中的细菌截留在无菌滤膜上；在无菌滤膜上；2）培养：）培养：将滤膜有菌面朝上贴于伊红美兰将滤膜有菌面朝上贴于伊红美兰培养基或远藤氏培养基，经培养基或远藤氏培养基，经37C培养培养16hr18hr；3）结果观察：）结果观察：培养培养16hr18hr后，挑选深后，挑选深红色或紫红色、不带或带有金属光泽的菌红色或紫红色、不带或带有金属光泽的菌落，或者淡红色、中心色较深的菌落进行落，或者淡红色、中心色较深的菌落进行革兰氏染色观察，确定大肠菌群细菌。革兰氏染色观察，确定大肠菌群细菌。G-：接入乳糖培养液中，复发酵；：接入乳糖培养液中，复发酵；G+：阴性结果。：阴性结果。经染
25、色证实为经染色证实为G-无芽孢杆菌者，再接入乳糖无芽孢杆菌者，再接入乳糖蛋白胨半固体培养基中，蛋白胨半固体培养基中，37C培养培养68hr，产气者判定为大肠菌群阳性。，产气者判定为大肠菌群阳性。4）结果计算：）结果计算：根据滤膜上的大肠菌群数根据滤膜上的大肠菌群数及滤过水量，求出及滤过水量，求出1L水中大肠菌群数量。水中大肠菌群数量。v计算公式：计算公式：总大肠菌群数总大肠菌群数=滤膜上的菌落数以滤膜上的菌落数以2060个个/片为适宜。片为适宜。5）评价报告：）评价报告：v根据测定的数值写出检测水样的细菌学根据测定的数值写出检测水样的细菌学检测结果，予以评价。检测结果，予以评价。滤膜上生长菌落数滤膜上生长菌落数1000过滤水样量（过滤水样量（mL）v滤膜法的优点：滤膜法的优点：省时、省料、设备要求低；省时、省料、设备要求低；可以采集较多的检验水样。可以采集较多的检验水样。局限性：局限性：v易受悬浮物干扰；易受悬浮物干扰；v受其它细菌的干扰；受其它细菌的干扰；v受水样中毒物的干扰。受水样中毒物的干扰。