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1、终稿工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦 第八章 工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化 分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解;包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高;包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速
2、离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化;包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。第一节 包涵体形成的原因 ,(什么是包涵体 所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构(如 Cys 含量高)，如
3、低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质(如核糖体元件、RNA 聚合酶、内毒素、外膜蛋白质 ompC、ompF 和 ompA 等)，以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图 8-1)。包涵体一般大小为 0.13.0 m，具有很高的密度(约 1.3 mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的 50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的 结构而较少的,结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。图 8-1 在大肠杆菌中表达的包涵体(
4、来源于 Dr.Hauke LiLie),(形成包涵体的原因 包涵体形成的原因是多方面的，归纳起来大致有以下几方面:(1)基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平:研究发现在蛋白质低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是蛋白质合成的速度太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，二硫键不能正确的配对，疏水基团外露等。一般当表达的目的蛋白质量超过细菌总蛋白质量的 10%时，就很容易形成包涵体。(2)重组蛋白质的氨基酸组成:一般而言含硫的氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量也明显与包涵体的形成呈正相关。(3)宿主菌及其培养条件:较高的发酵温度容易导致包涵体的
5、形成，而降低宿主菌的培养温度被证明对增加重组蛋白的可溶性表达是有效的。主要原因可能是降低温度可以增加折叠中间体的稳定性或减少折叠中间体之间错误的相互作用，特别是疏水作用。丰富的培养基被认为有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，也容易导致包涵体的形成。此外选择合适的宿主菌，改变培养基的 pH 等方法有时也能增加重组蛋白质的可溶性表达。(4)重组蛋白质缺乏翻译后修饰:由于大肠杆菌表达系统属于原核表达系统，缺少真核细胞中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，故致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。(5)蛋白质在合成之后，于中性 pH 或接近中性 pH 的环境下，其本身固有的溶解度
6、对于包涵体的形成比较关键。这其实与蛋白质本身的性质有关，如果蛋白质合成后，其本身的溶解度比较高，就不容易形成包涵体。(6)在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。第二节 包涵体的制备和溶解 基因工程发酵液经离心浓缩后，可用机械磨碎法、超声波处理法或溶菌酶加去污剂的方法使细菌裂解，裂菌程度可通过取样镜检来确定。裂菌完成后离心收集沉淀即为包涵体，离心分离包涵体时的离心力不宜过大，离心时间不宜过长，以电泳检测上清中基本不含重组蛋白质即可，这样可以减少沉淀中菌体细胞膜碎片、核糖体等的含量从而提高粗制包涵体的纯度。包涵体分离方法的选择与所表达蛋白质的性质没
7、有明显关系。为了去除粗制包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，可应用洗涤液洗涤包涵体。洗涤液通常选用去污剂 Triton X-100、脱氧胆酸钠、蔗糖、尿素、盐酸胍等配制。但必须注意过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解。经洗涤后的包涵体的纯度一般可达到 80%左右。洗涤、纯化后的包涵体必须用含变性剂的溶液使之溶解。溶解的过程一般应包括包涵体蛋白质的变性和错配二硫键的还原。包涵体蛋白质变性常用的变性剂有47mol/L 的盐酸胍，68 mol/L 的尿素，以及一些去污剂如 1%2%的 SDS、脱氧胆酸盐等。有时不用变性剂而采用 pH2.04.5 的酸性溶液也可以使包涵体溶解。在使用变性剂溶解包涵体时
8、最通常选用的是盐酸胍，这主要有两方面原因:一是因为盐酸胍是一种相对更强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解;二是由于尿素分解的异氰酸盐会导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是长时间处于碱性环境下时如此，而使用盐酸胍则可以避免这一问题的产生。例如用盐酸胍溶解人 IL-4 包涵体可以提高它的复性率，而用尿素溶解则得不到有活性的蛋白质。如果蛋白质含有半胱氨酸，则包涵体中可能含有分子内和分子间二硫键，这时应添加还原剂如二硫苏糖醇(DTT)、还原性谷胱甘肽(GSH)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、胱胺、,-巯基乙醇(,-MT)等使二硫键通过硫醇-二硫化物交换而还原。常用的是 DTT 和,-MT。DTT 的还原
9、能力比-MT 强，因此 DTT 的用量一般比,-MT 少。但Fischer 等比较了多种溶解包涵体的实验方案后认为，包涵体的溶解、还原方法与它的天然构象中含有的二硫键的数目之间没有明显关系。对于有些没有二硫键的蛋白质加不加还原剂都不影响包涵体的溶解;但是对于另一些没有二硫键的蛋白质，还原剂的使用常常可以增加其溶解性，这可能是由于含有二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。实验方法举例。1(材料和仪器:(1)TE1 缓冲液:Tris-HCl 50 mmol/L pH8.0，EDTA 1 mmol/L，NaCl 100 mmol/L(2)TE2 缓冲液:0.5%Triton X-100(V/V)，Tri
10、s-HCl 20mmol/L，pH 7.0，EDTA 1mmol/L,NaCl 100 mmol/L (3)变性液:盐酸胍 6 mol/L，Tris-Cl 20 mmol/L pH 7.0，EDTA 1 mmol/L,NaCl 100 mmol/l(4)低温高速离心机,超声裂菌仪 2(操作步骤:(1)称取 30 g 湿菌置于 500 ml 烧杯中，加入 300 ml TE1 缓冲液，加入搅拌子搅拌 20 min，使菌体分散均匀。(2)将上述烧杯置于冰浴，用超声破菌仪超声破菌 20-40 次(30 s/次，间隔 30 s)，每隔 10 次取样涂片作革兰氏染色，显微镜下检查，当每个视野内未破菌?2
11、 个时，超声破菌结束。(3)将超声破菌液转移至 500 ml 离心管，在低温高速离心机上，7 000 rpm，4?离心 20 min，弃上清。(4)在沉淀中加入 300 ml TE2 缓冲液，加入搅拌子搅拌 30 min。取出搅拌子，将装有悬浊液的离心管在低温高速离心机上，7 000 rpm，4?离心 20 min，弃上清。(5)在沉淀中加入 150 ml 变性液，加入搅拌子搅拌溶解 2 h。取出搅拌子，将装有悬浊液的离心管在低温高速离心机上，8 000 rpm，4?离心 30 min，将上清转移至一个 500 ml 烧杯中。所得上清即为变性的蛋白液。不同包涵体的大小和密度并不相同，因而离心分
12、离的时间和转速应通过实验确定。以分离的上清经蛋白质电泳基本不含目的蛋白质即可，不宜使用过高的转速和过长的时间，以使一些细胞膜碎片留在上清中，从而提高包涵体的纯度。对包涵体的洗涤方法是可选的，且 Triton X-100 和盐酸胍的浓度也应通过实验确定。蛋白质变性剂的种类和浓度也应通过实验确定。第三节 包涵体的复性 一、影响包涵体复性的因素 复性的过程主要包括肽链的折叠和分子内二硫键的氧化，这是两个相互影响的过程，适当折叠的肽链常常有利于二硫键的形成，同时，正确的二硫键形成有利于折叠产物的稳定。变性蛋白质在去除或降低变性剂浓度后，就会自发地由变性时的热力学不稳定状态向热 力学稳定状态转变。这一过
13、程是一个复杂的过程，主要包括变性剂去除或降低后，变性蛋白质从伸展态迅速卷曲形成第一中间态，也称融球态(molten globues，MG)的形式。在这种状态下，蛋白质的疏水基团处于蛋白质的表面。然后融球态蛋白质的疏水基团向蛋白质内部折叠成疏水核心，即转变为第二中间态，并进一步折叠为天然态，这一过程相对缓慢。融球态由于其表面的疏水分子在分子间碰撞中容易发生分子间可逆的暂时缔合，形成二聚体，二聚体进一步缔合就会形成多聚体，最终形成沉淀。因而这一步是影响一些蛋白质复性回收率的限速步骤。除此之外，影响蛋白质复性的因素还有很多，如蛋白质浓度、变性剂浓度、复性的方法等，下面举例说明。(一)蛋白质浓度 复性
14、过程中正确折叠的蛋白质往往得率很低，这通常是由于多肽链的聚集作用引起的。蛋白质浓度是促使蛋白质聚集的主要因素。聚集反应是一个分子间反应，它至少涉及两条肽链。它的速度与蛋白质浓度的 n(n?2)次方成正比。折叠中间体在高浓度下产生聚集的主要原因之一是由于暴露在它们表面的疏水基团的相互作用，而折叠过程与蛋白质的浓度无关。因此为了减慢聚集反应，蛋白质的浓度一般应控制在 10-100 mg/L。分子缔合与 MG 向第二中间态转变不同，后者主要是一级反应，其速度往往随蛋白质浓度的增加而增加，因而在变性蛋白质复性工作中降低蛋白质浓度往往可以提高复性的效率，但实际上过低的浓度又会给后续纯化工作带来困难，而且
15、在工业生产中通过降低蛋白质的浓度来减慢聚集反应的速度也是不经济的，这需要消耗大量的复性液，同时增加工作量。因而应通过实验来选择合适的蛋白质浓度，目前认为这一浓度通常为 10-200 mg/L。(二)氧化还原条件 对于含有二硫键的重组蛋白，在复性时需要考虑为之提供合适的氧化还原条件以使之形成正确的二硫键。常用的方法有以下几种。1(空气氧化法 这是直接利用空气中的氧气氧化变性蛋白质使之形成正确二硫键的方法。使用该方法时，合适浓度的金属离子如二价铜离子，锌离子等可以促进空气的氧化作用。但是该方法较难实现对整个过程的精确控制。2(硫化物氧化法 这是利用硫化物提供的氧化还原条件而促使变性蛋白质中半胱氨酸
16、间形成正确二硫键的方法。氧化还原环境可由氧化型谷胱甘肽-还原型谷胱甘肽提供，也可由胱氨酸-半胱氨酸提供。该方法的优点是可以通过控制硫化物的浓度和比例来控制氧化的程度，缺点是比较昂贵。3(DTT 氧化法 变性蛋白质的半胱氨酸与氧化型 DTT 反应形成一个不稳定的折叠中间体，该中间体可随着还原型 DTT 的释放和分子内二硫键的形成而分解，最终实现二硫键的正确形成。利用该方法也可以通过控制氧化型 DTT 的浓度来实现对氧化程度的控制。4(温度和 pH 为了防止蛋白质的水解，一般认为复性温度在 4?最好;另外，蛋白质样品肯定是未经灭菌的，因此较低的温度有利于抑制细菌的生长。同时复性液的 pH 值必须在
17、 7.0 以上，这样就可以防止自由硫醇的质子化作用影响二硫键的正确配对和形成，一般而言复性的最佳 pH 值为 8.0-9.0。5(无规凝聚抑制剂或协同因子的添加 聚乙二醇(PEG)、甘油、环状糊精，葡萄糖、硫胺、Triton X-100、蔗糖等分子的添加可有效地促进变性蛋白质的正确折叠，它们可通过不同的作用提高复性的效果。如盐酸胍能保护没有折叠或部分折叠分子的疏水基，从而减少了分子间的缔合和沉淀的形成。L-Arg 则能通过增大折叠中间体的的溶解性而提高变性蛋白质的复性率。PEG、蔗糖则能促进变性蛋白质的溶解，提高具有天然构象蛋白质的最终得率。6(分子伴侣的添加 分子伴侣是由于它们在体外可促进其
18、它蛋白质的折叠而不参与其最终产物的形成而得名，许多实验表明它们在体外可促进蛋白质的复性。二、复性的方法 (一)稀释复性 该方法是通过用缓冲液或含有低浓度变性剂的溶液稀释蛋白质变性液，使蛋白质变性液中变性剂的浓度下降，以促进变性蛋白质肽链的折叠。稀释的方法有一步稀释、分步稀释和 2+连续稀释等。稀释的同时，在稀释液中加入 GSH、Cu 等巯基氧化剂，以促进二硫键的形成。一步稀释是在复性开始时，变性液用缓冲液或含低浓度变性剂的溶液快速稀释，使变性剂浓度和蛋白质浓度一步降低到较低浓度，其特点是操作简单，而且复性开始时蛋白质浓度已降低至较低，有利于复性中间体的形成;但由于变性剂浓度迅速降低，不利于复性
19、中间体的稳定，因而有时反而容易形成沉淀。分步稀释和连续稀释则是将变性液用缓冲液或含低浓度变性剂的溶液逐步稀释，复性中间体存在于较高浓度的变性剂溶液中，有利于稳定中间体，但由于蛋白质浓度也是逐渐降低的，在复性开始时蛋白质的浓度还是比较高的，易于产生中间体的缔合。对于不同的蛋白质，复性采用何种稀释方法应由实验确定。(二)透析复性 该方法是先用变性液将已变性蛋白质的浓度稀释降低到较低浓度(如 0.010.2 mg/mL)，而变性剂浓度不变，然后将稀释后的蛋白质变性液转入合适的透析袋中，用含低浓度变性剂和巯基氧化剂的复性液透析，逐步降低变性剂的浓度，并在巯基氧化剂存在的条件下逐步复性。这种方法避免了一
20、步稀释复性时变性剂浓度变化过快及分步稀释和连续稀释时初始蛋白质浓度较高的问题，该方法的缺点是规模放大较为困难。透析时可进行一步透析，即直接用不含变性剂的的透析外液进行透析;也可采用梯度透析，即使透析外液中变性剂的浓度逐步降低。一步透析常常会在透析袋中出现大量沉淀，类似于快速稀释时产生的沉淀，而梯度稀释则效果会好一些。另外，由于透析袋内和透析体系中溶氧有限，GSH 氧化不足，所以另外加入合适浓度的 GSSH 并采用较长的复性时间非常重要。稀释复性和透析复性的原理大同小异，而且它们都比较适合较小规模的复性(1 L 以下)，在大规模复性过程中(10 L 以上)，由于搅拌困难和透析体积有限，有人利用类
21、似的原理采用了将复性溶液泵入变性蛋白质溶液的方法，效果很好。这种方法可使变性剂浓度随蛋白质浓度的降低而缓慢的降低，并可以减少沉淀的大量生成，使复性的条件变得更加温和，从而使大规模复性也可以达到甚至略高于小规模复性体系的复性效率。下面介绍透析复性常用的实验方法。1(材料和仪器 (1)变性的蛋白溶液:盐酸胍 6 mol/L,Tris-HCl 20 mmol/L,pH 7.0,EDTA 1 mmol/L,NaCl 100 mmol/L，蛋白浓度约 5 mg/mL (2)稀释液:盐酸胍 6 mol/L,Tris-HCl 20 mmol/L,pH 7.0,EDTA 1 mmol/L,NaCl 100 m
22、mol/L (3)透析内液:经稀释的变性蛋白液 (4)透析外液:含有不同浓度盐酸胍的 TE(Tris-HCl 20 mmol/L,pH 7.0,EDTA 1 mmol/L,NaCl 100 mmol/L)(5)透析袋:截留分子量为 3000 Da (6)低温高速离心机 2(操作步骤 (1)将变性的蛋白溶液用稀释液稀释后，装入预处理过的透析袋中，两端封闭。(2)将上述透析袋放入装有透析外液的烧杯中，透析外液的体积为透析内液的20 倍，透析外液中盐酸胍的浓度为 3 mol/L，4?搅拌透析 12 h。(3)将透析袋取出，放入另一个装有透析外液的烧杯中，透析外液的体积为透析内液的 20 倍，透析外液
23、中盐酸胍的浓度为 1.2 mol/L，4?搅拌透析 12 h。(4)将透析袋取出，放入另一个装有透析外液的烧杯中，透析外液的体积为透析内液的 20 倍，透析外液中盐酸胍的浓度为 0.6 mol/L，4?搅拌透析 12 h。(5)将透析袋取出，放入另一个装有透析外液的烧杯中，透析外液的体积为透析内液的 20 倍，透析外液中盐酸胍的浓度为 0 mol/L，4?搅拌透析 12 h。(6)将透析好的溶液转入离心管中，在低温高速离心机上，10 000 rpm，4?离心 30 min，收集上清即为蛋白复性液。透析前应对蛋白的浓度进行定量，然后用稀释液对其进行稀释。因为变性蛋白溶液中蛋白的浓度在复性中很重要
24、，蛋白浓度越低，复性回收率越高，但是可能给后续纯化工作带来难度，所以在实验中也应通过预实验确定最合适的蛋白浓度。(三)色谱法复性 该方法是直接通过层析使蛋白质复性。根据分离原理的不同，常用于复性的色谱法有体积排阻色谱法(SEC)、离子交换色谱法(IEC)、亲和色谱法(AFC)、疏水色谱法(HIC)。这 4 种色谱的相同之处是色谱固定相对蛋白质复性做出了贡献。根据所采用的固定相不同，色谱复性法也可分为以刚性基质硅胶为固定相的高效液相色谱(HPLC)和以非刚性基质为固定相的中压色谱和常压色谱。比较蛋白质复性的各类指标，高效液相色谱是一个较理想、具有发展前途的方法，它包括反相高效液相色谱(RPLC)
25、、高效疏水色谱法(HPHIC)等。高效疏水色谱法是一种廉价的通用型蛋白分离和纯化的工具，它特别适用于用硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶液溶解后的溶液，如 7 mmol/L 盐酸胍或 8 mmol/L 尿素的蛋白溶液，所以特别适用于大肠杆菌表达的重组蛋白的提取液。其固定相是从高浓度盐溶液中吸附变性蛋白质，且与变性剂瞬时分离。这不仅大大降低蛋白质分子间的聚集作用，还因固定相能在分子水平上为变性蛋白质提供很高的能量，使水化的变性蛋白质瞬时失水并形成局部结构以利于蛋白分子从疏水核开始折叠。此外梯度洗脱使各种蛋白质分子可以“自己选折”对自己有利的条件进行折叠，以达到同固定相和流动相间的协同作用
26、，更有利于复性最优化条件的选择。用该方法对变性蛋白进行复性时，复性效率一般大于 90%。与稀释复性和透析复性相比较，色谱复性法具有以下几项优点:去除变性剂快;可明显减少变性蛋白质在脱离变性剂后由于分子聚集而产生的沉淀，从而提高复性蛋白的质量和活性;使蛋白质复性与杂蛋白的分离同时进行;以及便于变性剂回收。凝胶层析为例，将变性蛋白质上凝胶柱后，用不含变性剂的平衡液洗涤柱子，在较低的蛋白质浓度下，蛋白质经过凝胶颗粒时在填充料间穿行，使得分子与分子间有一定的距离和自由空间进行折叠而不受其它分子的影响，周围的平衡液提供合适的pH 值及离子强度，蛋白质分子缓慢从柱子顶端流到底部时，逐步与变性剂分开，即折叠
27、成有活性的物质，这个过程是相对匀速的并且速率可根据不同的蛋白质进行调整。色谱法复性中，消耗的变性剂较少，只有稀释复性的 1%;高纯度的变性剂价格高，使用的变性剂量少，可使成本降低。已经有报道证明色谱法复性的效率高于透析复性和稀释复性。但是色谱法在使用流动相置换变性剂时，可能产生变性蛋白质分子之间聚集而形成少许的沉淀，这些沉淀在进行梯度洗脱时常常也不能溶解在洗脱能力很 强的流动相中，有时甚至在浓的变性剂溶液中，这些沉淀也不能完全溶解。这些沉淀积累后就会使柱压很快升至很高甚至报废。此外，色谱法复性在大规模复性中的应用还有待于进一步的改进和尝试。下面以用高效疏水色谱法对,-淀粉酶的纯化复性为例简介色
28、谱法复性的步骤。1(材料和仪器 ,),-淀粉酶(,-Amylase)(2)流动相 A 液:(NH4)SO 3.0 mol/L,KHPO 0.05 mol/L pH 7.02424 (3)流动相 B 液:KHPO 0.05 mol/L pH 7.0 24(4)Shimadzu LC-6A 高效液相色谱仪,低温高速离心机 (5)色谱柱为 100 mm4 mm,介质为 XDF-GM XDF-SGM 型疏水填料 2(操作步骤 (1)取标准,-Amy 2.0 mg 溶于 7.0 mol/L 盐酸胍，使胍变,-Amy 浓度为 2.0 g/L(2)将胍变,-Amy 于 20?恒温变性 24 h (3)取变性
29、蛋白液在低温高速离心机上，10 000 rpm，4?离心 30 min，收集上清上柱(4)从 100%的 A 液到 100%的 B 液线性梯度洗脱 25 min 5)从 100%的 B 液到 100%的 A 液线性梯度洗脱 10 min，流速 0.8 ml/min,检测波长(280 nm,0.08 AUFS (6)收集各种色谱流分，对,-Amy 活性进行测定。(四)高蛋白质浓度下的复性 当蛋白浓度高于 200mg/L 时，我们将其称为高浓度的蛋白，在这种情况下，通常采用两种方法对其进行复性。第一种方法是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够
30、的时间进行折叠复性;第二种方法是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。如 Hevehan 等通过改变复性液的组成和复性条件对 1 g/L 和 5 g/L高浓度的变性蛋白质成功进行了复性。他们表明在复性液中存在低浓度的盐酸胍和L-Arg 时能有效地提高高浓度变性溶菌酶的复性率，使其达到 95%。这种方法也非常简便，因为它不需要在复性前除去还原剂和变性剂，只需要把变性的蛋白质快速地稀释到含非变性浓度的盐酸胍复性液中。(五)其它方法 除了上述四种常用的复性方法以外，人们还尝试了许多其它的方法来对包涵体
31、蛋白质进行复性，如超滤复性、吸附法、反胶束复性法、双水相复性法等。超滤复性法较多应用于生产中，其优点是规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。反胶束复性法的原理是蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束内，由于这样可使蛋白质相互分离，减少了蛋白质折叠过程中的聚集作用，通过逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化-还原对，可使变性蛋白质复性。有人用硫氰化钠、氯化钠、溴化锂与聚乙二醇构成的双水相系统使得包涵体的溶解与蛋白质的折叠复性在一步双水相技术操作中完成。由于 PEG 具有稳定蛋白质构象的作用、高
32、浓度盐则具有去稳定的作用，这样正确折叠的蛋白质会不断进入到另一相中，直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡。三、复性效果的检测 蛋白质复性后，需进一步对蛋白质的复性效果进行检测。根据不同蛋白质的具体特性和实验需要，可以从以下几个方面对蛋白质的复性效率进行检测。1(丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是用于检测蛋白质的常用方法。一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。2(生物学活性及比活性测定 复性蛋白的活性一般可通过细胞学方法或生物化学的方法进行测定，但是值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不一定相同，
33、而且常常不能完全反映体内活性。3(免疫学方法 蛋白的功能通常取决于其结构。一般来说只有具有正确构像的蛋白质才能行使正确的生物学功能，所以一些免疫学方法如 ELISA、Western-blot等，往往可以用于检测蛋白质的折叠状态，特别是对结构决定簇的抗体检验。4(色谱方法 由于处于变性状态和复性状态下的蛋白，其色谱行为不相同，所以也可用色谱的方法对之进行检测。5(光谱学方法 处于变性状态和复性状态下的蛋白的光谱学特征也不相同，所以还可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等光谱学的方法检测蛋白的复性情况，但这些方法一般只用于研究复性的过程。粘度和浊度测定 复性后的蛋白溶解度增加，而变性状
34、态下的蛋白质由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出，所以粘度和浊度也可以作为检测蛋白质复性效果的一个指标。第四节 包涵体复性以后的蛋白质纯化 复性后的蛋白质可采用常用的蛋白纯化的方法对之进行纯化，如先经盐析、超滤、等电点沉淀、双水相萃取等对蛋白进行粗纯化，然后用色谱法对之进行精细纯化。在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行疏水色谱法纯化，目标峰经适当稀释后进行离子交换色谱法纯化，然后通过体积排阻色谱法脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行离子交换色
35、谱法纯化，其优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便会降低很多收率，所以可进行两到三次柱层析纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。这些方法的详细操作步骤在本书的相关章节有详细介绍，故在此就不再详细说明。(秦鑫)参考文献 1 吴乃虎.基因工程原理(下).第二版.北京:科学技术出版社,2002:135-154 2 Latchman DS.Eukaryotic Transcription Factors.2nd ed.London:Academic Press,1995:612-628 3 Lehninger A,Nelson DL and Cox MM.Principles of Biochemistry.3rd ed.New York:Worth Publishers,2000:238-246 4 Meyers RA.Molecular Biology and Biotechnology-A Comprehensive Desk Reference.New York:VCH Publishers,1995:356-387