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1、 EB病毒（EBV）核酸检测标准操作规程（荧光PCR法）1.目的 规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行EB病毒DNA分析。2.应用范围 使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。3.职责 由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。4.内容 4.1 实验原理及其临床应用 本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷
2、酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒（EBV）DNA。用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床提供参考，4.2 标本采集 4.2.1 使用标本类型：全血。4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合 5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。4.2.3 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20待测，保存期为6个月。标本运送采用0冰壶。4.3 试剂准备 4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司。4
3、.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20。4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。4.4 质控品 4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。4.4.2 质控品保存条件：置于-20冰箱中保存。4.4.3 质控频度：每次实验均需做质控。4.5 操作过程说明 4.5.1 DNA提取 4.5.1.1 质控品处理：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数秒，吸50ul至0.5ml 灭菌离心管中，加入50ulDNA提取液充分混匀，100恒温处理101分钟；12000 rpm离心5分钟，备用。
4、4.5.1.2 样本处理 4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；4.5.1.2.4 2000rpm 离心20分钟（建议用水平离心机）；4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟；4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，100恒温处理101分钟；12000rpm离心5分钟，上清备用。4.5.2.1 加样
5、：取PCR反应管若干，加入处理后的样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品）上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。4.5.3 PCR扩增 将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反应：37-2min；94-2min；（94-15ses；55-45ses）40 cyclics；EBV检测荧光素：FAM;反应体系：50ul；荧光信号收集：55-45ses，末端收集。4.5.3 Mx3000P 荧光定量PCR仪的设置及结果分析 4.5.3.1 打开计算机电源。4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听
6、到滤镜轮转动的声音。打开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿色。如果不是绿色而是红色，软件会提示，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。“Add Plateau with Ramp”。要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。如果要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。点击，导入以前设定的PCR程序。（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步的全过程都采集荧光信
7、号，一般用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。若要去除，可将其拖出循环设定区域。4.5.3.8 结束之后，点击软件界面右上方的。会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直接点击“马上运行”，但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status，点击Start开始实验。在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。还可以选择勾选“Turn lamp off at end of run”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。4.5.3.9 在PCR运行的过
8、程中可以点击，观察样品的实时扩增原始结果。4.5.3.10 PCR运行结束后，点击，再点击Results，软件将自动进行结果分析，也可点击手动进行结果分析。可以手动调节阈值线（拖动）进行分析。点击可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。左下角的可选择相应的荧光观察扩增曲线。右边的可根据自己的需要选择显示的界面。是扩增曲线，Ct值列表，标准曲线，样本起始浓度，结果excel表格输出，合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。4.5.3.11 分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中的Smoothing对曲线进行调节，一般Amplification average是
9、3，可按需要将其调至较大数值，如5、7、9，调整后曲线将更光滑，不过Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，通常情况下，不建议这么做。4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独的基线设置，点击中的Baseline Correction，点击Adaptive baseline，在下面对应的各孔，单独进行基线起始和终止位置的调节。4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。点击桌面 Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择Multiple Experiment Analysis（多项实验结果分析）选项，点击“OK”，出现如下对话框，建议选择“Use common thresh
10、old”进行分析进算，然后点击，导入需要一起分析的上机文件，点击“Finish”即可。4.5.3.14 这里选择时要注意：1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序；2.每次程序中的循环数应该一致。在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。4.5.3.15 分析质控结果：阴性质控品：EBV(FAM)Ct值=40或“No Ct”。阳性质控品：EBV（FAM）Ct值33，且有较好的对数增长曲线。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。4.5.3.16 记录实验数据。4.5.3.17 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩
11、增管破裂而导致污染。4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析 4.5.4.1 先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，打开仪器数据库。4.5.4.2 双击图标“”，启动罗氏480软件。4.5.4.3 在弹出的对话框中，输入用户名和密码，进入软件设置界面。4.5.4.4 在弹出的界面中，点击“”，进入新的实验设置界面：。4.5.4.5 在“”菜单栏里，“”子菜单下。4.5.4.6 将“Detection Format”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。4.5.4.7 将“Reaction Volume”设置为“50ul”。4.5.4.8 在“Pro
12、grams”下：通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并在“变性延伸退火”循环阶段的“Analysis Mode”下选择Quantification。4.5.4.9 在“Temperature Targets”下：通过“”“”来增加每个循环阶段里的小步骤，并在采集荧光的小步骤的“Acquisition Mode”里选择“single”，采集荧光。4.5.4.10 在“”菜单栏下，通过“”增加或者减少实验项目类型，通过右边的孔位选择，设置不同项目的区域，然后点击“Apply”保存。4.5.4.11 在“”菜单栏下，Step 1处，选择“Abs Quant”；Step 2处，编辑标准品及样
13、本。4.5.4.12 标准品设置：在Step 2下的96孔面板中，选中标准品反应孔，然后选择右侧的模 板检测通道，如“483-533”，然后将下方孔位的“Quantification Sample Type”选择为“Standard”，并在“Concentration”处输入其浓度即可。4.5.4.13 样本设置：类似于标准品设置，但仅需要编辑其“Sample Name”即可。4.5.4.14 返回“”菜单，在“”子菜单右下角点击“”，运行实验。4.5.4.15 实验结束后，在“”菜单下，选择“Abs Quant/Fit Points”，进入结果分析界面：【Analysis】：在此菜单下对阈值
14、线进行调整；【Noise Band】：对实验的信噪比进行调整；【Filter Comb】：对不同荧光通道进行选择；【Std Curve】：对定量参考品进行选择，包括实验中的参考品、导入的标准品等；4.5.4.16 在上述操作完成后，点击“”；在“”菜单中，根据需要选择报告中需包含的项目，然后得出结果。4.5.4.17 分析质控结果：阴性质控品：EBV(FAM)Ct值=40或“No Ct”。阳性质控品：EBV（FAM）Ct值33。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。4.5.4.18 记录实验数据。4.5.4.20 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，
15、丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。4.5.4.21 关闭扩增仪电源和计算机电源。4.6 结果判定 EBV阳性：（EBV-FAM）Ct36，且有较好的对数增长曲线。EBV阴性：（EBV-FAM）Ct值=40或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)。EBv检测灰度区：（EBV-FAM）36Ct样本40，因实验存在系统及人为不确定性因素，应重复检验确认。4.7 参考值：阴性。4.8 注意事项 4.8.1 PCR荧光定量检测法比较容易受污染，所以实验过程中应尽量避免反复开盖，所用耗 材均需高压灭菌。4.8.2 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融。4.8.3 实验完毕应用有效氯终浓度为2000mg/L的消毒液擦拭桌面，并打开紫外线灯消毒。本作业指导书颁发部门:质管部 本作业指导书分发部门：PCR室 本作业指导书编写人:编写日期：年 月 日 本作业指导书审核人：审核日期：年 月 日 本作业指导书审批人:执行日期：年 月 日