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1、毛细管电泳的基本原理及应用毛细管电泳的基本原理及应用摘要摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法;该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等;可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等,比 HPLC 分析高效、快速、微量;关键词：关键词：毛细管电泳原理分离模式 应用1 1 概述概述毛细管电泳 Caillary Electrophoresis 简称 CE,是一类以毛细管为分离通道,以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术;CE 的历史可以追溯到 1967 年瑞典
2、 Hjerten最 先 提 出 在 直 径 为 3mm 的 毛 细 管 中 做 自 由 溶 液 的 区 带 电 泳 Capillary ZoneElectro-phoresis,CZE;但他没有完全克服传统电泳的弊端1;现在所说的毛细管电泳 CE是由 Jorgenson 和 Lukacs 在 1981 年首先提出,他们使用了 75mm 的毛细管柱,用荧光检测器对多种组分实现了分离;1984 年 Terabe 将胶束引入毛细管电泳,开创了毛细管电泳的重要分支:胶束电动毛细管色谱 MEKC;1987 年 Hjerten 等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行;同年,Cohen 发表了毛细管凝胶电
3、泳的工作;近年来,将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中,又发展了电色谱,扩大了电泳的应用范围;毛细管电泳和高效液相色谱 HPLC 一样,同是液相分离技术,因此在很大程度上 HPCE与 HPLC 可以互为补充,但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说,毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳 C E 除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外,其仪器结构也比高效液相色谱 HPLC 简单;C E 只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器;毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点,因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材
4、料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域2;2 2 毛细管电泳的设备和基本原理毛细管电泳的设备和基本原理毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法3;毛细管电泳仪的基本组成如图 1、1 所示;熔融石英毛细管的两端分别浸在含有电解缓冲液的贮液瓶中,毛细管内也充满同样的电解缓冲液;在毛细管接收端之前安装在线检测系统;被分析样品可以从进样系统采用重力法、电迁移法、抽真空法等多种进样方式引入到毛细管的进样端;当样品被引入后,便开始在毛细管两端施加电压;样品溶液中溶质的带电组分在电场的作用下根据各自
5、的荷质比向检测系统方向定向迁移;CE 中的毛细管目前大多是石英材料;当石英毛细管中充入 pH 值大于 3 的电解质溶液时,管壁的硅羟基-SiOH 便部分解离成硅羟基负离子-SiO-,使管壁带负电荷;在静电引力下,-SiO-会把电解质溶液中的阳离子吸引到管壁附近,并在一定距离内形成阳离子相对过剩的扩散双电层 见图 24;在外电场作用下,上述阳离子会向阴极移动;由于这些阳离子实际上是溶剂化的水化的,它们将带着毛细管中的液体一起向阴极移动,这就是 CE 中的电渗流 EOF;电渗流的强度很高,以致于所有进入毛细管中的样品,不管是阴离子、阳离子或中性分子,都会随着液体向阴极移动;因待测样品中正离子的电泳
6、方向与电渗流方向一致,故最先到达毛细管的阴极端;中性粒子的电泳速度为零,迁移速度与电渗流速度相当；而负离子的电泳方向则与电渗流方向相反,但因电渗流速度约等于一般离子电泳速度的 57 倍5,故负离子也将在中性粒子之后到达毛细管的阴极端;由于各种粒子在毛细管内的迁移速度不一致,因而使各种粒子在毛细管内能够达到很好的分离;3 3 毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式根据分离原理不同,CE 分离基本模式有 6 种,如表 1 所示;表 1毛细管电泳的分离模式和应用Tab.1 Separation modes and application of CE以上各模式以毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电
7、动毛细管色谱这3 种应用较多;4 4 毛细管电泳的应用毛细管电泳的应用CECE 在药物成分分析中的应用在药物成分分析中的应用目前,CE 在天然中草药分析领域中的应用主要集中在生物碱和黄酮及其甙类方面、蒽醌类分析也有报道;生物碱有类似于碱的性质,在pH 11,使糖基上的羟基去质子而带负电荷,直接进行电泳分离,用紫外 195nm 检测;也可以选用硼酸盐缓冲液,硼酸盐与糖基络合形成带负电荷的络合物以进行电泳分离,用紫外检测;简单单糖的分析方法也适于简单寡糖的分析12;多糖一般利用酸解或酶解的方法将其转化为寡糖后进行分析;糖蛋白经蛋白酶酶解后生成糖肽,糖肽的图谱被认为是糖蛋白的指纹图谱;糖肽的分离主要
8、是基于其pKa值的不同而进行CE分离,并不是基于糖链结构的不同,因此所选用的缓冲液的组成及其 pH 的选择尤为重要,其检测也是基于蛋白质的检测;糖脂既可以直接用CE分离,也可以用神经酰胺聚糖酶将糖链释放出来后进行分析;糖胺聚糖 GAG 类糖基的聚糖部分有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素等,一般都含有重复的二糖单元,而且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖,这些寡糖既带电荷又有紫外吸收 232nm,因此很适合用 CE 进行分析;另外,CE 在糖型分析方面也取得了较大的成功;在糖的检测方面,紫外分析是最早用于 CE 进行糖类检测的,但它的灵敏度相对不高,检出限一般只有106mol数量级;利用激光
9、诱导荧光检测对糖类进行柱前高效荧光标记,可使检出限达到10-9mol水平;在改进检测系统的同时,中性糖类的极性标记也在不断改进与完善;其中一种极性标记物为 8-氨基-萘-1,3,6-三磺酸,利用其可以快速高效地对均一寡糖和复杂多糖进行分离分析,具有很高的分辨率;CECE 在临床化学上的应用在临床化学上的应用CE 在临床化学中的应用十分广泛,所检测样品的来源可分为尿样、血浆血清、脑脊液、红细胞、其它体液或组织以及实验动物活体invivo 试验;被分析的组分则包括肽类、各种蛋白、病毒、酶、糖类、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、离子、药物及其代谢产物;具体应用可分为:临床疾病诊断 临床蛋白分析、
10、临床药物监测、代谢研究、病理研究、同工酶分析、聚合酶链反应PCR 产物分析、DNA 片断及序列分析等;所应用的 CE模式包括 CZE、MECC、CGE、CITP 和毛细管等电聚焦 CIEF;CECE 用于检测非均一性多样性用于检测非均一性多样性,Heterogeneity,Heterogeneity许多纯化蛋白,甚至在它们的天然状态,往往都不是单一分子片断,而是由相关分子组成,称为非均一性多样性;产生多样性的原因有:氨基酸 AA 的序列不同,如突变体的某位置AA 改变或AA 侧链改变;后转译产生不同长度的多肽链;糖蛋白不同程度的糖基化,如存在不同数量的寡糖链,寡糖链有不同的单糖组成、序列及单糖
11、之间的异构连接;采用 CZE,MECC,CIEF,CE-MS 可检测这些非均一性;用于心脏病的重组人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂 rtPA 含 4 个可能糖基;Yim15用 CZE 和 CIEF 研究了制备过程中rtPA 不同糖基化程度引起的非均一性,结果表明,CIEF方法要比CZE 的好;还有用CZE对人促红细胞生成素 rHuEPO16、用 MECC 对重组人 C2 干扰素 IFN2C17及 CE-MS18研究蛋白的多样性;有关蛋白的非均一性在临床中的一些应用,如人铁传递蛋白、血清蛋白的变异、异构酶的分析等;4.7 CE4.7 CE 用于农药残留量的分析用于农药残留量的分析对农药残留物的测定国
12、外研究的较多;Lazer 等19将飞行时间质谱和毛细管电泳仪联用,采用样品堆积技术进样对 Paraquat 和 Diquat 两种除草剂进行了分离,检测限低至 10-17mol/L;Farran 等20采用乙腈=50%的磷酸-硼砂缓冲液分离出两种苯氧羧酸类除草剂;Hinsmann 等21通过自动在线浓缩样品,采用固相微柱以十二烷基硫酸钠 SDS 作胶束,添加少量乙腈,在13min内分离测定了水中的 7种不同种类的农药;磺酰脲类化合物是一类相对较新的除草剂,因此这一类化合物在水和食品中的残留量的测定十分重要;Lipez Avila 等22采用 3mODS 硅胶填充柱来分离这一类化合物,线性范围为
13、 1100mg/L;Mayer 等报道了农药 Cinosulfuron 及其副产物的毛细管电色谱的分离分析;游静等23对毛细管电泳在农药手性拆分的进展做了综述;CE CE 用于纯度检测用于纯度检测CE 在国外分子生物学实验室及生物工程药厂里已广泛用作最有效的纯度检测手段;当蛋白的疏水性相近时,它们在 HPLC 柱中往往同时流出,因此在对蛋白进行结构研究包括 N 端序列和肽谱之前,必须监测从 HPLC 所得肽片断的纯度;快速 CE 纯度检测可节约样品和节省序列测定所需时间;因CE 和RP2 HPLC 分离机理不同,所以当用CE 检查由RP2HPLC 纯化制得的某一合成肽一个峰,纯度为%时,发现分
14、出 6 个组分,主峰纯度仅为 50%;或许这就是部分基因工程产品用 HPLC 检测纯度很高而实际生物活性却各批差异很大的一个原因;至于用 CE 对药厂生产及 QC 作纯度检测的应用实例比比皆是,如对胰岛素、白细胞介素、人生长激素、粒性巨噬细胞菌落刺激因子用 CIEF 等的检测;纯度检测时用CE 可检测出多肽链上单个氨基酸的差异;CE 用于纯度检测可用CZE,MECC,SDS2 CGE,CIEF 多种模式;还有文献讨论了用不同方法包括 RP2 HPLC,IEC2 HPLC,SDS2PA GE 及 CE 进行纯度检测的最有效的策略24;5 5 结结 论论作为一种蛋白质、多肽、核酸及其他生物分子分离和分析的重要技术,近 20 年来,毛细管电泳的机理探索和应用研究都取得了长足的进展,对毛细管电泳的研究,使其分离效率和分析精度不断提高,也使其应用领域不断扩大,推动了生物技术的不断发展;毛细管电泳今后发展方向仍是继续提高分辨率、速度和检测器的选择性;同时,增加自动进样装置和使之微机化、商品化;另外,将它与质谱仪更好地结合,可对生物分子特性作出更快、更准确的分析,以进一步拓宽毛细管电泳在生物领域的应用范围;