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1、纤纤维维素素酶酶的的检检测测方方法法新新-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1纤维素酶的检测方法纤维素酶的检测方法摘要：摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。关键词：关键词：纤维素酶 酶活测定 葡萄糖 回归方程一、纤维素酶及其降解原理一、纤维素酶及其降解原理纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的 30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的 40%。据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质
2、就有 5 亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达吨，其中尚有 89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。自 1906 年 Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，
3、医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切-1,4-葡萄糖酶，也称 Cx 酶）、外切酶（外切-1,4 葡萄糖酶，也称 C1酶）、-1,4 葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）1。C1 酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。Cx 酶又分为 Cx1 酶和 Cx2 酶。Cx1 酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。Cx2 酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于-（1,4）糖背键，逐步切
4、断-（1,4）糖节键生成葡萄糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖。纤维素酶在降解纤维素过程中的作用机理至今还不是很清楚。目前关于 Cx 酶、C1 酶和-1,4 葡萄糖酶这 3 种酶的作用机理的假说比较公认的是以下 3 种，其中协同理论最为广泛接受。（1）C1-Cx 假说。该理论认为首先由 C1 酶作用于纤维素酶的结晶区，再由外切酶和-葡萄糖苷酶联合作用产生二糖和葡萄糖。其水解模式如图 1 所示。图 1 C1-Cx 假说示意（2）顺序作用假说。该假说认为首先由内切酶随机的作用于纤维素的葡萄糖苷键，打开缺口，然后由外切酶在新生键末端切下一个纤维二糖，再由-葡萄糖苷酶将它水解成葡萄糖。（3）协
5、同作用假说。该理论认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位形成葡萄糖。二、纤维素酶的检测方法二、纤维素酶的检测方法2纤维素酶各组分的底物专一性不同，而且纤维素酶是多组分复合物。纤维素酶作用的底物也比较复杂，同时不同来源的纤维素酶其组成及各组分的比例有较大的差异，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。其中主要的检测方法有：棉线切断法，滤纸崩溃法，羧甲基纤维素钠为底物的粘度减少和还原糖增加的测定法2，分光光度计法3，快速测定纤维素酶 CMC 液化活力法4，平板法，巴鲁阿-斯温
6、(Bamch and swain)测定法5。对于细菌等对纤维素分解能力强的微生物，由于对其酶的形成、分泌和作用机制研究较少，这些测定方法不一定适用。但目前对于这些方法测定的具体数值的可信度、可比性，却没有相关的报道研究。下面主要通过四种方法进行实验，研究这些实验方法的稳定性，从而为实验研究提供一定的参考依据6。、材料与方法材料：主要仪器 HH-6 型恒温水浴锅；22PC 型分光光度计；HG1001 型电热鼓风干燥箱；FA2004 型电子分析天平；UV-2401 型紫外双光束分光光度计实验方法：试剂的配置：（1）醋酸-醋酸钠缓冲液：冰醋酸定容至 100ml，称取 27,2g 的醋酸钠溶解并定容至
7、 100ml 将上述两种溶液等体积混合。（2）3,5-二硝基水杨酸溶液（DNS）：称取 3,5-二硝基水杨酸于 500ml 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入 2mol/ml NaOH 溶液 262ml，再加入到 500ml 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后移入 1000ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至 1000ml，贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。（3）CMC-Na 溶液：称取 羧甲基纤维素钠，加热溶解，定容至 100ml7。酶活测定方法葡萄糖标准曲线的绘制原理：3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定
8、范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系，利用分光光度计测出其在 520nm 处的吸光度，得出还原糖的量。葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖放在 110烘箱中烘 2h 至恒重，称取烘好的葡糖糖，溶解并定容至 100ml。取 16 支具塞试管，依次编号为 0,1,2,3,4,5,6,7 并作平行实验。由于各种方法反应体系的总体积不同，所以需作不同的标准曲线，所加的量也有所不同。现以总体积为 9ml 体系为例：表 1 葡萄糖标准曲线绘制方法管号01234567葡萄糖量（ml）蒸馏水（ml）DNS(ml)0722162225223422摇匀后置于沸水浴中加热 5min 后，冷却定容至 25ml。摇匀后以
9、 0 号管为对照于最大吸收波长处测定 OD 值，以葡萄糖含量mol 为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制标准曲线。酶活测定方法的比较3配制不同浓度的标准酶液：用去离子水 100ml 来溶解 100mg 纤维素酶（1000IU），配制成 1mg/ml 酶液。测定时分别吸取，上述酶液用水补足至 1ml 即为不同浓度的酶液。（1）滤纸酶活（FPA）测定方法滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法，此方法应用广泛，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活（Filter Paper Activity，FPA）方法：取 1ml
10、酶液加 1ml L、的醋酸缓冲液，预热到 50，加入 1 条 1x6cm 新华滤纸（501mg），50保温 1h。取出，沸水浴灭活 5min，冷却至室温，用 3ml DNS 试剂显色后稀释 3 倍，测 OD 值（520nm）。OD 值越大，说明该菌株的酶活力越强8。酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖mol 数；其中：60 为保温时间（酶与底物作用时间，min）；Ew 为粗酶液的体积（ml）；是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成 1mol 葡萄糖的酶量。（2）羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定方法原理：纤维素酶对 CMC-Na 有降解能力，生成葡萄糖等还原糖，再用 DNS 法显色，用
11、标准葡萄糖溶液作标准液，22PC 分光光度计在 520nm 处测其吸光度，以每分钟生成相当于 1mol 的葡萄糖为一个酶活性单位。取 3 支带有 20ml 刻度的试管，1 支管作空白对照，2 支管作平行样品管。每支样品管中加 1ml 酶溶液，置于 50水浴锅中预热 2min，然后在 3 支试管中分别加入 4ml 已预热至50的底物溶液，准确计时 5min 取出，每管立即分别加入 1ml 2mol/L 氢氧化钠溶液和 2mlDNS 显色液，摇匀后在对照管中再加入 1ml 酶液。将 3 支试管放入沸水浴中，5min 后立即取出，流水冷却，用蒸馏水定容至 20ml，于 520nm 处测 OD 值。酶
12、活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖mol 数；其中：5 为保温时间（酶与底物作用时间，min）；Ew 为粗酶液的体积（ml）；是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成 1mol 葡萄糖的酶量。（3）染色纤维素测定方法9用考马斯亮蓝使滤纸染色酶解后在最大吸收波长处测释放的着色物的吸光值，代表酶活，以吸光度为纵坐标，酶浓度为横坐标做曲线。在实际测定时，先利用紫外双光束分光光度计进行波长扫描，发现其在 536nm 处吸收峰最高，因此在实验时以此波长作为测定波长。（4）CMC 粘度降低测定方法底物溶液 9ml，加酶液 1ml，40，测定底物粘度减至一半时所需时间，以奥氏粘度计测定。以 10min 能使底
13、物粘度降低一半的酶活作为一个单位。结果与分析葡萄糖标准曲线绘制实验中所用的标准葡萄糖曲线绘制结果如下：由于在以后的测定中，各方法的反应体系并不相同，所以每个体系须有各自的葡糖糖标准曲线作为今后的参照。CMC 糖化力测定参照图 1，有三条曲线，是因为在常用测定中酶与底物不同，而造成它们各自体系的溶液的总体积也不相同，因此此方法的葡萄糖标准曲线有三条。滤纸法参照图 2。4图 1 CMC 酶活测定法葡糖糖标准曲线(不同体系)所得三条曲线的回归方程如下：y1=图 2 滤纸法葡糖糖标准曲线所得曲线的回归方程：y=标准纤维素酶酶活曲线酶活测定方法结果比较如下：表 2 标准纤维素的 CMC 酶活力和滤纸酶活
14、力测定结果CMC 酶活力测定法滤纸酶活力测定法（FPA）含酶量（mg/mL）0查得葡萄糖OD 值量（mol）00酶活（U/mL）0查得葡萄糖OD 值量（mol）00酶活（U/mL）05所得曲线的回归方程:y=R2=y=R2=实验结果表明：用标准纤维素酶所做的 CMC 酶活测定和滤纸酶活测定，从回归曲线可以看出他们的线性较好，可以充分说明这 2 种方法比较稳定。而且 CMC 酶活测定法和滤纸酶活测定法在很多报道中均在采用，这样使实际实验的结果更具可比性。所得曲线的回归方程：y=所得曲线的回归方程：y=由上述结果可知：CMC 粘度降低法的线性没有滤纸酶活测定法和 CMC 酶活测定法来得好，而且在实
15、验过程中，两个平行实验之间有较大的误差。但从回归方程就能看出，该方法的稳定性较其他 3 种方法有很大的偏差。表 3 标准纤维素的 CMC 粘度降低法和染色纤维素法测定结果CMC 粘度降低法染色纤维素法含酶量（mg/mL）0所用时间（min）0酶活（U/mL）0OD 值0酶量（mg）06结论本次实验研究了纤维素酶测定方法中常用的 4 种方法，即：FPA 测定法、CMC-Na 酶活性测定法、染色纤维素测定法以及 CMC 粘度降低测定法，比较了这 4 种方法测定的线性相关性以及稳定性，经过实验研究表明，FPA 测定法和 CMC-Na 酶活性测定法较稳定，线性相关性较高，可以作为研究测定的可靠方法。三
16、、纤维素酶的应用与发展趋势三、纤维素酶的应用与发展趋势纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸、和生物能源等工业应用上具有重要地位。自 20 世纪 90 年代开始，酸性纤维素酶用于牛仔布的水洗整理(biostoning andbiofinishing)，从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用，这也是目前纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。在牛仔布的水洗整理上酸性纤维素酶具有用量少、效果快的特点，但服装返染严重；中性纤维素酶反应条件温和而且不易返染，织物档次得到提高，已普遍代替酸性酶。但在棉织物的整理上，如去球(depilling)脱毛
17、(reduced fuzz)以及增柔(softness)等，酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤维素酶仍具有更多的优势。利用纤维素酶对棉织物的整理并不需要纤维素酶的所有组分，如进行棉织物的脱毛、去球等整理，仅有内切酶就可产生明显的效果，但是棉织物的减量也较严重，影响了织物的强度，通过基因工程改变内切酶和外切酶的比例，可以在一定程度上解决这个问题。纤维素酶用于造纸工业，是利用外切纤维素酶只从末端切断纤维素的作用原理，提高纸张的光洁度。碱性纤维素酶用于洗涤剂工业，可以提高棉织物的洗净度，起主要作用的是内切酶(CMC 酶)，是近些年来洗涤剂工业竞相开发的新酶种之一。这两种工业应用涉及的纤维素酶只需要纤维素
18、酶系中的单一组分，基因工程技术可以在其中得到广泛的应用。纤维素酶将来最大的用途，或者可以使其产量得到巨大增长的工业需求将是纤维素乙醇的开发。自上世纪 70 年代石油危机以来，世界各国都致力于开发新的可再生能源，而生物乙醇(bioeth-anol)是被普遍看好的新型燃料。进入 21 世纪，利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇，可以避免对粮食作物的大量损耗，引起了各国政府和研究机构的重视，这其中的关键是纤维素酶的成本问题。由于纤维素酶发酵活力较低，因此其应用成本也较高。同时纤维素酶相比其他糖苷水解酶类，比活力至少要低 12 个数量级，如滤纸酶的比活力为 1 IU/mg 左右，C
19、MC 的比活力约为 10 IU/mg，从而造成酶的作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶颈问题，也是纤维素酶研究的热点与难点。目前通过传统的菌7种诱变和基因工程技术可以较大幅度地提高目的蛋白的表达量，从而提高酶的发酵水平，如诺维信公司与美国能源部合作，将制造纤维素乙醇中的酶制剂成本由 2001 年的每加仑 5 美元降低到 2004 年的 30 美分，2005 年又降低到每加仑 18 美分。还可以通过改善发酵条件和工艺，如采用固体发酵来大幅度降低发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要，深入研究纤维素酶的结构与功能以及作用方式，进而对其进行有效改造;或者通过筛选新的产酶菌种，发现具有开
20、发潜力的新酶源。总之，纤维素酶是目前糖苷酶类中惟一尚有大量亟待解决问题的酶，也是有着巨大工业和市场潜力的酶。进一步阐明纤维素酶的结构与功能，研究纤维素酶的基因表达与调控的关系；针对不同工业需要研制不同组分比例的纤维素酶；提高纤维素酶水解天然纤维素的比活力；开发适应不同温度(低温或高温纤维素酶)的纤维素酶是当前纤维素酶的主要研究趋势。参考文献1刘晓晶，李田，翟增强.纤维素酶的研究现状及应用前景J.安徽农业科学，2011,39（4）：192019212 张瑞萍.纤维素酶活力测定方法 J.印染,2002,(8):38-3913施特尔马赫 B(着).钱嘉渊(译).酶的测定方法M.北京:中国轻工业出版社,1992:84-1124湖北省微生物研究所纤维素酶组.快速测定纤维素酶中 CMC 液化活力法 J.微生物学通报,1979,(5):115康纪婷，等.纤维素酶活力测定方法J.河北农业科学，2010,14（4）：1511436赵玉萍，杨娟.四种纤维素酶酶活测定方法的比较J.食品研究与开发，2006,27（3）：1161187张树政，等.酶制剂工业M.北京：中国轻工业出版社，20048傅力，等.纤维素酶测定方法的研究J.新疆农业大学学报，2000,23（2）：45489林祥木，童金秀，陈汉清，等.产纤维素酶株的筛选及产酶条件的选择J.福建农林大学学报，2003,32（4）：5105138