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1、安徽阜阳劣质奶粉“大头娃娃”事件 第1页/共27页第五节 蛋白质及氨基酸的测定Determination of protein and amino acids 二、蛋白质的测定三、氨基酸含量的测定一、食品中蛋白质含量的测定意义第2页/共27页一、食品中蛋白质含量的测定意义第五节 蛋白质及氨基酸的测定第3页/共27页（一）凯氏定氮法(Kjeldahl method)1、原理:测定过程分为三个阶段，反应式如下：(1)样品消化 2CH3CHCOOH+13H2SO4 NH2 (NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O催化剂催化剂第五节 一、蛋白质的测定二、蛋白质的测定第4页/共27页第五节
2、蛋白质的测定凯氏定氮法样品消化第5页/共27页(2)碱化、蒸馏与吸收碱化、蒸馏与吸收 (NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+Na2SO4+2H2O 2NH3+2H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(3)滴定滴定 (NH4)2B4O7+2 HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3 第五节 蛋白质的测定凯氏定氮法第6页/共27页第五节 蛋白质的测定凯氏定氮法第7页/共27页微量凯氏定氮装置第五节 蛋白质的测定凯氏定氮法第8页/共27页自动凯氏定氮仪自动凯氏定氮仪第五节 蛋白质的测定凯氏定氮法第9页/共27页2、方法特点与适用范围 本法测得的结果为“粗蛋白”含量，适用于各类食品。3、操
3、作方法蛋白测定.swf第五节 蛋白质的测定凯氏定氮法讨论：如何测得纯蛋白质含量？讨论：如何测得纯蛋白质含量？第10页/共27页4、结果计算蛋白质含蛋白质含氮量氮量%换算系换算系数数蛋白质含氮蛋白质含氮量量%换算系换算系数数蛋或肉蛋或肉16.06.25燕麦燕麦17.155.83牛乳牛乳15.76.38大豆大豆17.515.71小麦小麦17.545.70大米大米16.815.75玉米玉米16.06.25花生花生18.325.46第11页/共27页5、注意事项（3）蒸馏时加碱量要足（4）蒸馏装置要密闭不漏气（1）样品消化时注意热源强度（2）样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入过氧化氢23
4、 mL后再加热第五节 蛋白质的测定凯氏定氮法第12页/共27页（二）双缩脲法(Biuret method)1、原理NH2CONHCONH2 +NH3150160CuSO4NaOH紫红色的配合物紫红色的配合物NH2CONH2+NH2CONH2560nm处有特征吸收处有特征吸收第五节：一、蛋白质的测定第13页/共27页2、适用范围及特点 本法适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类样品的测定。特点是操作简单，但灵敏度低。第五节：一、蛋白质的测定第14页/共27页3、操作步骤、操作步骤 (1)5mL双缩脲试剂和1mL蛋白质溶液(110mg蛋白质mL)混匀。试剂包括硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠以及稳定在
5、碱性溶液中的铜离子；(2)混合液在室温下放置15min或30min，然后在560nm处比色，读取吸光度值，并扣去空白；(3)如果反应液不澄清，在测定吸光度前可过滤或离心；(4)用牛血清白蛋白(BSA)建立蛋白质浓度与吸光度的标准曲线。第15页/共27页4、说明、说明（1）该方法比凯氏定氮法费用低，速度快(可在不到30min的时间内完成)，是分析蛋白质最简单的方法；（2）几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应；（3）不需要测定非多肽或非蛋白质来源的氮。（4）不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，如明胶的双缩脲反应产生红紫色；（5）此方法不是一个测量绝对值的方法，必须用已知浓度的蛋白质(如BSA)
6、或经凯氏定氮法校正。第16页/共27页（三）水杨酸比色法 (salicylic acid colorimeitry)1、原理蛋白质蛋白质+硫酸硫酸硫酸铵硫酸铵水杨酸钠次氯酸钠蓝色化合物蓝色化合物在在660nm660nm处比色测定处比色测定2、适用范围：同凯氏定氮法、适用范围：同凯氏定氮法第五节：一、蛋白质的测定第17页/共27页二、氨基酸含量的测定（一）双指示剂甲醛滴定法（Indicator formaldehyde-titration methord）1、原理、原理第五节:二、氨基酸的测定第18页/共27页2、适用范围及特点 适用色浅至无色的样品，测定结果为游适用色浅至无色的样品，测定结果为
7、游离态离态氨基酸含量，其精确度仅达氨基酸氨基酸含量，其精确度仅达氨基酸理论含量的理论含量的90%90%。3、操作方法（课下自学）第五节:二、氨基酸的测定第19页/共27页4、注意事项（1 1）固体样品在）固体样品在50水浴中进行水浴中进行0.5h（2 2）样品颜色深，可加适量活性炭脱色后）样品颜色深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定再测定，或用电位滴定法进行测定第五节:二、氨基酸的测定第20页/共27页（二）电位滴定法 Potentiometric Titration methord1 1、原理、原理:同同双指示剂甲醛滴定法，双指示剂甲醛滴定法，只是用只是用酸度计测酸度计测定
8、溶液的定溶液的pH，判断滴定终点。，判断滴定终点。pH8.2，pH9.22 2、适用范围及特点、适用范围及特点:适用于各类食品，测定结果准适用于各类食品，测定结果准确确第五节:二、氨基酸的测定第21页/共27页（三）茚三酮比色法 1、原理 氨基酸在碱性溶液中与茚三酮起反应，生氨基酸在碱性溶液中与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，颜色的深浅与氨基酸含量成蓝紫色化合物，颜色的深浅与氨基酸含量成正比，于成正比，于570nm570nm处比色定量。处比色定量。2、适用范围、适用范围 适用于微量氨基酸的检测适用于微量氨基酸的检测第五节:二、氨基酸的测定第22页/共27页二、氨基酸自动分析仪法 1、原理 食物
9、蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。2、试剂 3、仪器 4、测定方法（1）样品处理 匀浆、称样（2）水解（3）测定 5、结果计算第23页/共27页小结一、蛋白质的测定（一）凯氏定氮法（二）双缩脲法（三）水杨酸比色法二、氨基酸含量的测定（一）双指示剂甲醛滴定法（二）电位滴定法 （三）茚三酮比色法第五节 蛋白质及氨基酸的测定第24页/共27页习题1、说明凯氏定氮法的基本原理和特点。理解所加入每一种试剂的作用2、说明用双缩脲法测定蛋白质的原理3、若要测得样品中的蛋白氮含量，需对样品进行如何处理？4、测定氨基酸的方法有哪些？说明其原理和适用范围第五节 蛋白质及氨基酸的测定第25页/共27页习题1、测定蛋白质的意义是什么2、凯氏定氮的依据是什么测定蛋白质的原理?3、掌握GB5009.5-2003的操作方法及注意事项4、了解氨基酸测定的三种方法和适用范围第26页/共27页感谢您的观看！第27页/共27页