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1、细胞因子的检测方法：1)生物学方法 依赖性细胞株：生物分析法 功能检测：生物分析法 2)分子生物学方法 分子杂交技术：mRNA的测定 多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定 3）免疫学方法 免疫测定：免疫酶技术 功能测定与抗体抑制 第1页/共39页 抗体检测技术抗体检测技术 1 1）免疫酶技术）免疫酶技术 2 2）免疫荧光技术）免疫荧光技术 3 3）间接血凝试验）间接血凝试验 4 4）放射免疫测定）放射免疫测定 5 5）蛋白印迹）蛋白印迹 6 6）免疫共沉淀）免疫共沉淀 第2页/共39页酶联免疫吸附测定(ELISA)Enzyme linked immunosorbent assay 第3页
2、/共39页 该试剂盒是基于NP30抗独特型抗体可替代虫源性抗原的特性研制而成的。在国内、外均属率先应用生物技术制备抗原代替传统虫源抗原。已证实NP30检测的血吸虫抗体属短程抗体，治疗后阴转较快，具有疗效考核价值。该试剂盒的诊断效能多项指标均已达到或超过经典抗体检测法，较以前病原学检查和免疫学检测方法更为简便快速。仅用一滴血，20分钟即可判读结果，不需其他仪器设备，便于在基层、现场使用。本试剂盒已在血吸虫流行区已应用近120万人次。第4页/共39页实验原理实验原理 酶联免疫吸附测定是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫技术，此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速，因其具有微量、特异
3、、高效、经济、方便和安全等特点，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。第5页/共39页实验原理实验原理 ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体。1、使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。2、使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。3、按一定步骤进行抗原抗体反应。4、加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。第6页/共39页方法类型方法类型 ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试剂来源、标本性状以及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法。1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心
4、法 4.双夹心间接法第7页/共39页第8页/共39页一、试剂及仪器准备一、试剂及仪器准备 免疫吸附剂固相载体 要求：吸附力强 能保持Ag或Ab活性 不参与化学反应 载体性能比较 载体材料：+、-结果差别大 ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10%。第9页/共39页 常用载体：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板2.Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高3.免疫吸附剂(固相Ag或Ab)：包被：将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法 封闭：包被后在用15%小牛血清白蛋 白再包被，以消除非特异吸附的干扰。第10页
5、/共39页 酶结合物：1.酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。2.ELISA常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等 3.酶的底物：HRP可溶性底物及呈色：邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm)5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色：DAB(棕黄色)-萘酚(红色)，3-氧基-9-乙基卡唑(红色)4-氯-1-萘酚(灰蓝色)第11页/共39页 AP可溶性底物及呈色：对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光 AP不可溶性底
6、物及呈色：NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色 -半乳糖苷酶：4-甲基伞基-半乳糖苷：荧光4.酶结合物的制备：戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法第12页/共39页（三）设备：（三）设备：酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISAELISA光度计。针对固相载体形式的不同，各有光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良重复性、精确度和可测范围、线性等等
7、。优良的酶标仪的读数一般可精确到的酶标仪的读数一般可精确到0.0010.001，准确性为，准确性为1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%。操作时室温宜在操作时室温宜在15-3015-30，使用前先预热，使用前先预热仪器仪器15-3015-30分钟，测读结果更稳定。测读分钟，测读结果更稳定。测读A A值时，值时，要选用产物的敏感吸收峰，如要选用产物的敏感吸收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波长。波长。有的酶标仪可用双波长式测读有的酶标仪可用双波长式测读。第13页/共39页第14页/共39页二、操作步骤二、操作步骤（间接间接ELISAELISA法）法）1.样本的收集；2.包被抗原；
8、3.封闭；4.加稀释的待检样品；5.加酶标抗抗体；6.加底物显色；7.终止反应。第15页/共39页（一）样品的收集和保存：（一）样品的收集和保存：1.溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用 于HRP的辅基)；2.细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”(破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白)；3.反复冻融可使抗体效价下降而假“-”；4.陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本 底增加；5.标本中含NaN3，可出现假“-”。第16页/共39页（二）包被（二）包被 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附
9、结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。故更易吸附到固相载体表面。第17页/共39页包被的条件 pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液 pH7-8p
10、H7-8的的Tris-HClTris-HCl缓冲液。缓冲液。加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜或冰箱中放置过夜或3737中保温中保温2 2小时。包被浓度随载小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。第18页/共39页最适工作浓度的选择 可用棋盘滴定法在夹心ELISA法中选择包被抗体和酶标抗体工作浓度，即利用棋盘滴定，将包被抗体和酶标抗体稀释
11、成一系列浓度，反应后显色。阳性值在0.8左右，阴性值小于0.1为最适，可据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度第19页/共39页 方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为08左右，阴性参考血清A值01的包被抗原稀释度为工作浓度。第20页/共39页（三）封闭（三）封闭 封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无
12、关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥白质充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA;10%BSA;10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶;脱脂奶粉脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用比较价廉，可以高浓度使用（5%5%）。）。第21页/共39页（四）加样（四）加样抗原或抗体：纯化抗原/抗体(天然但干扰多)、合成抗原/抗体(多肽分子较小，常有空间位阻)
13、、基因抗原(与片段的选择和制备水平有关)第22页/共39页对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative(negative control)control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光
14、值与受检标本吸光值比较，可以度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。估计标本物质的量。阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。第23页/共39页（五）加酶标抗体（五）加酶标抗体即酶标记的抗体（或抗原）是即酶标记的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关键的试剂中关键的试剂纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价酶结合物保留活性部
15、分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。格低廉，有色产物易于测定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲酶半乳糖苷酶和脲酶等。等。第24页/共39页（六）显色（六）显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色
16、进行。助于加速显色进行。TMBTMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退至无色。第25页/共39页（七）结果判定（七）结果判定 拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点
17、，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。白孔的吸光度，然后进行计算。结果以光密度（结果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），现按规定用吸光度），现按规定用吸光度（absorbenceabsorbence，
18、A A），两者含义相同。通常的表示方法是将吸收波长写于），两者含义相同。通常的表示方法是将吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波长为的吸收波长为492nm492nm，表示方法为，表示方法为A492nmA492nm或或OD492nmOD492nm。第26页/共39页 1.1.定性测定定性测定 定性测定的结果判断作出定性测定的结果判断作出“有有”或或“无无”的回答，的回答，分别用分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。在这种半定量测定中，表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴
19、度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法在间接法和夹心法ELSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法孔。在竞争法ELISAELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔第27页/共39页 2.2.定量测定定量测定 ELSIAELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一特别
20、是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。标准曲线。测定大分子量物质的夹心法测定大分子量物质的夹心法ELISAELISA，标准，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈得曲线一般呈S S形，其头、尾部曲线趋于平坦，形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。第28页/共39页第29页/共39页三、基本操作注意事项三、基
21、本操作注意事项（一）加样（一）加样:在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。第30页/共39页（二）孵育孵育 ELISAELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。温育常采用属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。温育常采用的温度有的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度）等。（冰箱
22、温度）等。3737是实验室中常用的孵育是实验室中常用的孵育温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。第31页/共39页（三）洗涤（三）洗涤 洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。但却也决定着实验的成败。ELISAELISA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时塑料对
23、蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关操作中，洗涤是最主要的关键技术。键技术。第32页/共39页第33页/共39页第34页/共39页四、实验中常出现的问题四、实验中常出现的问题1.ELISA出现“一片黄”的原因：酶结合物浓度过高 底物不新鲜 洗涤不干净2.ELISA出现“一片白”的原因：载体吸附性能差 底物错 稀释液作包被液 加错试剂 包被时间过短 酶活力低或下降 样品含有NaN3。第35页/共39页间接间接ELISAELISA法法操作步骤操作步骤1.样本的收集；2.包被抗原；3.封闭；4.加稀释的待检样品；5.加酶标抗抗体；6.加底物显色；7.终止反应。第36页/共39页实验报告实验报告内容：实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果、讨论与分析要求：只接受纸质、手写体纸质、手写体报告。第37页/共39页样本收集包被抗原封闭加入待检样品，10min洗涤3次加入酶标二抗，10min洗涤3次洗涤3次加入显色液3、4液各一滴洗涤8次已完成未完成第38页/共39页感谢您的观看！第39页/共39页