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1、畜牧微生物学第六章微生物的畜牧微生物学第六章微生物的遗传与与变异异第1页，本讲稿共62页第一节 微生物遗传与变异的概念第二节 常见的微生物表型变异第三节 微生物变异的机理第四节 微生物变异株的获得及微生物遗传性的保存第2页，本讲稿共62页Review Genetics遗传学:science of heredityuHeredity,inheritance遗传:genetic substance transmitted from parentto offspring 子代uVariation变异:Inheritable,low rate(105108)uMutation突变:any change
2、 in the nucleotide sequence of the DNA in a cell.uModification饰变:on phenotype,not genotype uGenotype基因型:genetic makeupuPhenotype表现型:actual,expressed properties第一节第一节 微生物遗传与变异的概念微生物遗传与变异的概念第3页，本讲稿共62页微生物是遗传学研究中的明星：微生物是遗传学研究中的明星：t 微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。方便建立纯系。t 很多常见微生物都易于人工培养，
3、快速、大很多常见微生物都易于人工培养，快速、大 量生长繁殖，菌落形态特征的可见性和多样性。量生长繁殖，菌落形态特征的可见性和多样性。t 物种和代谢类型多样，易于积累不同的中间代谢物种和代谢类型多样，易于积累不同的中间代谢 产物或终产物。产物或终产物。t 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，易于形成营养缺陷型，操作性强。易于形成营养缺陷型，操作性强。第4页，本讲稿共62页研究微生物遗传学的意义研究微生物遗传学的意义微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基生物学基本理论问题时本理论问题时最热衷的最热衷的研究
4、对象研究对象研究对象研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代现代现代现代分分分分子生物学子生物学子生物学子生物学和和生物工程学生物工程学生物工程学生物工程学的发展，而且为的发展，而且为育种育种育种育种工作工作工作工作提提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。交的方向发展。第5页，本讲稿共62页Three Classical Experiments 三个经典实验三个经典实验三个经典实验
5、三个经典实验1.Transformation 转化2.Infection of bacteriophage噬菌体感染3.Reconstruction of plant virus 植物病毒重建第6页，本讲稿共62页三个证明三个证明DNA是遗传物质的经典实验是遗传物质的经典实验1、经典转化实验、经典转化实验肺炎链球菌：肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）；有致病能力）；R型（菌体无荚膜，菌落表面粗型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）糙，无致病能力）遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础第7页，本讲稿共62页1928年，年，F.Griffth作
6、了作了3组实验组实验:第8页，本讲稿共62页1944年，年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子精确重复了转化实验，确定了转化因子实验证明，将实验证明，将R菌转化为菌转化为S菌的转化因子是菌的转化因子是DNA第9页，本讲稿共62页2、噬菌体感染实验、噬菌体感染实验Hershey&Chases experiment of phage infectionConclusion:DNA was the physical carrier of heredity 遗传物质基础是DNA第10页，本讲稿共62页3.ReconstructionofTobaccoMosaicVirus(TMV)植物病毒重
7、建Nucleicacid,DNAorRNA,isthehereditarymaterialv为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。v将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。第11页，本讲稿共62页v选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1）RNA（TMV）蛋白质（HRV
8、）（2）RNA（HRV）蛋白质（TMV）v用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。v上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。第12页，本讲稿共62页朊病毒的发现和思考朊病毒的发现和思考v朊病毒含有微量的核酸，仍未发现？v朊病毒仅由蛋白质构成v朊病毒的遗传物质为蛋白质？第13页，本讲稿共62页质粒（质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿
9、主细胞一般是非必需的；质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。能，从而使宿主得到生长优势。第14页，本讲稿共62页质粒的结构特点质粒的结构特点通常以共价闭合环状通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称，简称CCC)的超螺旋双链的超螺旋双链DNA分子分子存在于细胞中；存在于细胞中；也发现有线型双链也发现有线型双链DNA质粒和质粒和RNA质质粒；粒；质粒分子的大小范围从质粒分子的大小范围从1kb左右到左右到1000kb；细菌质粒多在细菌质
10、粒多在10kb以内）以内）第15页，本讲稿共62页质粒的检测质粒的检测t 提取所有胞内提取所有胞内DNA后电镜观察；后电镜观察；t 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；t 对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。如抗药性初步判断。第16页，本讲稿共62页质粒的主要种类质粒的主要种类质粒所编码质粒所编码的功能和赋的功能和赋予宿主的表予宿主的表型效应型效应致育因子（致育因子（Fertility factor，F因子）因子）抗性因子（抗性因子（Resistance factor，R因子）因子）产细菌素的质粒产细
11、菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒（隐秘质粒（cryptic plasmid）第17页，本讲稿共62页Advantages of using plasmid as Advantages of using plasmid as vector in gene engineering vector in gene engineering 质粒作为基因工程载体的优势质粒作为基因工程载体的优势质粒作为基因工程载体的优势质粒作为基因工程载体的优势1
12、.Small size:easily used in DNA separation and manipulation 体积小,易操作2.Circular shape环形:keep DNA stable3.Independent starting point of replication:not controlled by nuclear genome 独立的复制起点4.Multiple copies多拷贝:increase exogenousDNA rapidly迅速复制外源DNA5.Antibiotic resistant gene:used as selective marker 抗生素抗
13、性基因作为选择标记第18页，本讲稿共62页一、形态和结构的变异一、形态和结构的变异3-6%食盐食盐鼠疫杆菌鼠疫杆菌多形态性多形态性(衰残型衰残型)。琼脂培基琼脂培基第二节第二节 常见的微生物表型变异常见的微生物表型变异第19页，本讲稿共62页 青霉素、溶菌酶正常形态细菌 L型变异型变异 抗体或补体 (部分或完全失去胞壁)正常霍乱弧菌霍乱弧菌L型一、形态和结构的变异一、形态和结构的变异第20页，本讲稿共62页特殊结构的变异：特殊结构的变异：42-43炭疽杆菌炭疽杆菌失去形成芽胞能力失去形成芽胞能力,毒性降低毒性降低10-20天天变形杆菌（变形杆菌（H）1%石炭酸石炭酸单个菌落（单个菌落（O）迁徙
14、生长迁徙生长鞭毛变异鞭毛变异一、形态和结构的变异一、形态和结构的变异第21页，本讲稿共62页第22页，本讲稿共62页二、菌落变异二、菌落变异v在陈旧培养基中长期培养光滑型菌落光滑型菌落粗糙型菌落粗糙型菌落S或在有免疫力的人体内Rvv失去失去LPSLPS的特异性多糖重复单位的特异性多糖重复单位vv同时伴有其他性状的改变同时伴有其他性状的改变第23页，本讲稿共62页Single cell sort of Salmonella culture results in different colony morphology Non-Genetic variation第24页，本讲稿共62页三、毒力变异三
15、、毒力变异v棒状噬菌体棒状噬菌体白喉棒状杆菌白喉棒状杆菌获得白喉毒素获得白喉毒素第25页，本讲稿共62页v胆汁、甘油、马铃薯培养基胆汁、甘油、马铃薯培养基牛型结核杆菌牛型结核杆菌卡介苗卡介苗13年年(230代代)三、毒力变异三、毒力变异第26页，本讲稿共62页四、耐药性变异四、耐药性变异v细菌对某种抗菌药物有敏感变成耐药的变异称为耐药性变异。v金黄色葡萄球菌耐青霉素的菌株已从1946年的14%上升至目前的70%以上。v有些细菌还表现为同时耐受多种抗菌药物，即多重耐药性，甚至产生药物依赖性。v含链霉素培基痢疾杆菌依链株(耐药菌株)长期培养第27页，本讲稿共62页四、耐药性变异四、耐药性变异第28
16、页，本讲稿共62页四、耐药性变异四、耐药性变异第29页，本讲稿共62页五、代谢的变异五、代谢的变异某种微生物原来在代谢过程中能全成某某种微生物原来在代谢过程中能全成某种营养成分的特性，会变为失去这种能种营养成分的特性，会变为失去这种能力，成为所谓的营养缺陷型。力，成为所谓的营养缺陷型。第30页，本讲稿共62页v肠道杆菌细胞壁脂多糖上的特异性多糖称为肠道杆菌细胞壁脂多糖上的特异性多糖称为OO抗原，抗原，具有属特异性；鞭毛蛋白称为具有属特异性；鞭毛蛋白称为H H抗原，具有种特异抗原，具有种特异性。性。血清学鉴定的基础血清学鉴定的基础。vOO与与H H是可以发生变异的。是可以发生变异的。六、抗原性的
17、变异六、抗原性的变异第31页，本讲稿共62页第三节第三节 微生物变异的机理微生物变异的机理表型的差异只与环境有关表型的差异只与环境有关特点：特点：暂时性、暂时性、不可遗传性、不可遗传性、表现为全部个体的行为表现为全部个体的行为一、非遗传性变异一、非遗传性变异 微生物受外界环境条件变化影响，产生诱导作用，使基微生物受外界环境条件变化影响，产生诱导作用，使基因表达暂时改变，某一表型性状随之发生改变，当除去该诱因表达暂时改变，某一表型性状随之发生改变，当除去该诱发条件时，可恢复原来的性状。发条件时，可恢复原来的性状。第32页，本讲稿共62页遗传型变异（基因转移、基因突变）遗传型变异（基因转移、基因突
18、变）：遗传物质改变，导致表型改变遗传物质改变，导致表型改变特点：特点：遗传性、群体中极少数个体的行为遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常（自发突变频率通常为为1010-6-6-10-10-9-9）第三节第三节 微生物变异的机理微生物变异的机理二、遗传性变异二、遗传性变异 在自然或人工条件下，微生物的基因发生了改变，使相应在自然或人工条件下，微生物的基因发生了改变，使相应的性状也发生变化，并可以遗传下去，这就是遗传性变异。的性状也发生变化，并可以遗传下去，这就是遗传性变异。第33页，本讲稿共62页（一）基因突变（一）基因突变基因突变基因突变（gene mutation）简称突变，是变
19、异的一种，）简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在的变化。突变率常在10-410-9范围内。范围内。第34页，本讲稿共62页Characteristics of Mutation Characteristics of Mutation 突变的特征突变的特征突变的特征突变的特征1.Spontaneous自发性2.Noncorrespondent 不对应性3.Rare 稀有性4.Independent 独立性5.Inducible 可诱发性6.Stability 稳定性7.Reversible
20、可逆性第35页，本讲稿共62页（二）基因转移（二）基因转移（transgenosistransgenosis）转化转导噬菌体转换接合基因转移的方式第36页，本讲稿共62页1.转化（转化（transformation）转化或转化作用转化或转化作用：受体菌（：受体菌（recipient或或receptor）直接吸收了来自）直接吸收了来自供体菌（供体菌（donor）的）的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供体菌从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供体菌DNA的受体菌的受体菌称为转化子（称为转化子（transforma
21、nt）。）。范围范围：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。转化发生的条件转化发生的条件:两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定都可发生转化。其不同菌株间也不一定都可发生转化。进行转化的受体细胞必须处于进行转化的受体细胞必须处于感受态感受态(competence)。即受。即受体细胞最易接受外源体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。片段并实现其转化的一
22、种生理状态。也可以采用人工的方法使细菌转变成也可以采用人工的方法使细菌转变成感受态感受态第37页，本讲稿共62页供体菌供体菌受体菌受体菌DNA片段片段1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转）的转化现象化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力第38页，本讲稿共62页自然转化过程的特点：自然转化过程的特点：a）不需要活的）不需要活的DNA供体细胞；供体细胞；b）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株
23、和转化受体菌株之间的亲源关系；转化受体菌株之间的亲源关系；c）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多。）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多。第39页，本讲稿共62页第40页，本讲稿共62页人工转化人工转化用用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一用多种不同的技术处理受体细胞，使其人
24、为地处于一种可以摄取外源种可以摄取外源DNA的的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高；质粒的转化效率高；第41页，本讲稿共62页2.转导（转导（transduction）：通过完全缺陷或部分缺陷：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象。获得新遗传形状的受体细胞称为转导子形状的现象。获得新遗传形状的受体细胞称为转导子（transductant）。）。普遍转导普遍转导：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段部分携：通过完
25、全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段部分携带到受体菌中，而实现其遗传性状传递到受体菌的转导现象带到受体菌中，而实现其遗传性状传递到受体菌的转导现象局限性转导局限性转导：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。第42页，本讲稿共62页第43页，本讲稿共62页Transduction1.Generalized transduction2.Specialized transduction第44页，本讲稿共62页3.噬菌体转换（噬菌体转换（phage conversion）：或称
26、溶原性转换：或称溶原性转换（lysogenic conversion）。当温和噬菌体感染其寄主）。当温和噬菌体感染其寄主细菌之后，噬菌体的基因整合于寄主基因组中，导致寄主细菌之后，噬菌体的基因整合于寄主基因组中，导致寄主的某些性状发生变异，称为噬菌体转换。的某些性状发生变异，称为噬菌体转换。第45页，本讲稿共62页4.接合（接合（conjugation）：供体菌通过性菌毛传递不同长供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。获得新性状的从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。获得
27、新性状的受体细胞称为接合子。受体细胞称为接合子。存在范围存在范围：细菌和放线菌中都存在接合现象。：细菌和放线菌中都存在接合现象。第46页，本讲稿共62页Transfer of plasmid DNA by conjugationvTheFplasmidofanF+cellisbeingtransferredtoaF-recipientcell第47页，本讲稿共62页一、从自然变异中筛选一、从自然变异中筛选诱变剂诱变剂物理因素物理因素化学因素化学因素紫外线紫外线激光激光离子束离子束X射线射线r射线射线温度温度烷化剂烷化剂碱基类似物碱基类似物吖啶化合物吖啶化合物二、传统的人工诱变方法二、传统的人工
28、诱变方法第四节第四节 微生物变异株的获得及微生物遗传性的保存微生物变异株的获得及微生物遗传性的保存第48页，本讲稿共62页三、原生质体融合（三、原生质体融合（protoplast fusion）概念概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。原生质体融合的优点：原生质体融合的优点：可以提高重组率可以提高重组率双亲可以少带标记或不带标记双亲可以
29、少带标记或不带标记可进行多亲本融合可进行多亲本融合有利于不同种间、属间微生物的杂交有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量通过原生质体融合提高产量 第49页，本讲稿共62页四、基因工程四、基因工程Incorporationintoartificialplasmidsofgenesfromawidevarietyofsourceshasmadepossiblethetransferofgeneticmaterialacrossvirtuallyanyspeciesbarrier。第50页，本讲稿共62页第51页，本讲稿共62页Mutants that are detectable
30、vNon-motilevNon-capsulatedvRoughcolonyvNutritionalvSugarfermentationvDrugresistantvVirusresistantvTemperaturesensitivevPigment第52页，本讲稿共62页按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（选择性突变株（selective mutant）：）：具有选择标记（如营养缺陷性、具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的
31、环境条件，如培养基、温度、基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。值等，就比较容易检出和分离到。非选择性突变株（非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。检查大量菌落并找出差异。第四节第四节 微生物变异株的获得及微生物遗传性的保存微生物变异株的获得及微生物遗传性的保存第53页，本讲稿共62页变异菌的一般筛选方法变异菌的一般筛选方法平皿快速检测法平皿快速检测法l变色圈法变色圈法l透明圈法透明
32、圈法l生长圈法生长圈法l抑菌圈法抑菌圈法l梯度平板法梯度平板法摇瓶培养法摇瓶培养法第54页，本讲稿共62页第55页，本讲稿共62页第56页，本讲稿共62页菌种保藏：菌种保藏：1.目的：目的：存活，不丢失，不污染存活，不丢失，不污染防止优良性状丧失防止优良性状丧失随时为生产、科研提供优良菌种随时为生产、科研提供优良菌种2.原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等）原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变，创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺
33、营养的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加以及添加保护剂等）保护剂等）五、五、微生物遗传性的保存微生物遗传性的保存第57页，本讲稿共62页 菌菌 连续在培养基上（内）移种连续在培养基上（内）移种 种种 生活态生活态 传代培养保藏法传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种连续在活宿主上（内）移种 保保 固体斜面固体斜面 藏藏 湿法湿法 半固体琼脂柱半固体琼脂柱 方方 休眠态休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法法 干法干法 藏在玻璃管内藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上吸附在合适的载体上第58页，本讲稿共62页几种常用菌种保藏方法的比较几
34、种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类*产孢子微生物各大类36月612月12年110年515年以上简便简便简便简便有效简便有效第59页，本讲稿共62页第60页，本讲稿共62页v v菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。换和使用的目的。v菌种保藏机构菌种保藏机构菌种保藏机构菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（法国里昂巴斯德研究所（IPL）国内外菌种保藏机构：国内外菌种保藏机构：第61页，本讲稿共62页第62页，本讲稿共62页