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1、肿瘤的分子诊断肿瘤的分子诊断Moleculardiagnosisoftumors 多基因疾病多基因疾病是指疾病的发生涉及是指疾病的发生涉及两个以上基因两个以上基因的结构或表达调控的改变。的结构或表达调控的改变。分子诊断是指利用分子生物学和分子遗传学的方法，通过检测分子诊断是指利用分子生物学和分子遗传学的方法，通过检测基因的存基因的存在、结构变异和表达的异常在、结构变异和表达的异常，对人类状态和疾病做出诊断的方法。，对人类状态和疾病做出诊断的方法。肿瘤的分子诊断肿瘤的分子诊断是指用分子生物学手段，通过是指用分子生物学手段，通过检测肿瘤相关基因的存在，检测肿瘤相关基因的存在，分析肿瘤相关基因的缺陷
2、、表达及其功能分析肿瘤相关基因的缺陷、表达及其功能，以达到肿瘤诊断的目的。，以达到肿瘤诊断的目的。概念一、肿瘤发生发展的分子机制一、肿瘤发生发展的分子机制 肿瘤自身原因肿瘤自身原因 外因外因内因内因无限增殖无限增殖转移转移空间空间资源资源 免疫监控免疫监控 攘外攘外 安内安内同流和污同流和污视而不见视而不见 肿瘤免疫监控失活肿瘤免疫监控失活功能丧失功能丧失一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤自身一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤自身Limitless replicativepotentialTissue invasion&metastasisSustainedangiogenes
3、isInsensitivity toanti-growth signalsSelf-sufficiency ingrowth signalsEvadingapoptosis一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤自身Self-sufficiency in growth signalsAutocrineloopsOver-expressionofreceptorReceptorisalwaysonDownstreamsignals一、肿瘤发生发展的分子机制一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤自身nExternal triggersnIntracellular triggersnDeath
4、 receptorsnCaspasesnSensors(8,9)nExecutioners(3)Evading apoptosis一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤自身Insensitivity to antigrowth signals一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤自身Sustained angiogenesisnVEGF(血管内皮生长因子)nFGF1/2（成纤维细胞生长因子）nThrombospondinnThalidomidenAvastin一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤自身Tissue invasion and metastases一、肿瘤发生发展的分子
5、机制1、肿瘤自身肿瘤自身Limitless reproductive potentialnHayflick hypothesisnLimited number of doublingsnTelomere maintenancenTelomerasenNot all tumor cells have this potentialnTumor stem cells(1)免疫监视系统免疫监视系统要素要素 识别力识别力攻击力攻击力组成组成分工分工快速反应快速反应特异反应特异反应 信息传递信息传递一、肿瘤发生发展的分子机制一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调、免疫监控失调（1）、）、免疫监视系统免
6、疫监视系统识别识别特异反应特异反应抗原递呈细胞抗原递呈细胞一、肿瘤发生发展的分子机制一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调、免疫监控失调（1）、）、免疫监视系统免疫监视系统攻击攻击效应细胞效应细胞一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调、免疫监控失调（2）、）、免疫监视系统与肿瘤发生免疫监视系统与肿瘤发生证据证据体内细胞突变随时在发生，但肿瘤不是随时发生。体内细胞突变随时在发生，但肿瘤不是随时发生。免疫缺陷与肿瘤发生免疫缺陷与肿瘤发生免疫功能与肿瘤发展免疫功能与肿瘤发展一、肿瘤发生发展的分子机制一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调、免疫监控失调（2）、）、免疫监视系统与肿瘤发生免疫
7、监视系统与肿瘤发生肿瘤监控失常原因肿瘤监控失常原因识别问题识别问题肿瘤自身肿瘤自身免疫细胞免疫细胞隐蔽抗原隐蔽抗原来源与正常细胞相同来源与正常细胞相同抗原递呈功能缺失抗原递呈功能缺失无视无视一、肿瘤发生发展的分子机制一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调、免疫监控失调（2）、）、免疫监视系统与肿瘤发生免疫监视系统与肿瘤发生肿瘤监控失常原因肿瘤监控失常原因杀伤问题杀伤问题肿瘤自身肿瘤自身免疫细胞免疫细胞杀伤免疫细胞杀伤免疫细胞抑制因子抑制因子功能异常功能异常抑制性免疫细胞抑制性免疫细胞一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调、免疫监控失调二、肿瘤的分子诊断内容二、肿瘤的分子诊断内容肿瘤标志
8、物的检测肿瘤标志物的检测 1978年年Herberman在美国国立癌症研究所召开的人类肿瘤免疫诊断会上提出的。在美国国立癌症研究所召开的人类肿瘤免疫诊断会上提出的。由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质,这些物质存在于肿瘤细胞的这些物质存在于肿瘤细胞的胞核、胞质、胞膜上或体液中；不存在于正常成人组织而见于胚胎组织胞核、胞质、胞膜上或体液中；不存在于正常成人组织而见于胚胎组织,或在肿瘤组织或在肿瘤组织中含量超过正常含量。存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生中含量超过正常含量。存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够
9、用免疫学、生物学及化学的方法检测。物学及化学的方法检测。原癌基因原癌基因癌基因癌基因病毒癌基因病毒癌基因肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因肿瘤转移相关基因肿瘤转移相关基因肿瘤耐药基因等肿瘤耐药基因等肿瘤相关基因细胞基因组中调控细胞增殖和分化且具有能够使正常细胞细胞基因组中调控细胞增殖和分化且具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因，包括病毒癌基因和细胞癌基因；发生恶性转化的基因，包括病毒癌基因和细胞癌基因；癌基因在正常细胞的基因组中癌基因在正常细胞的基因组中存在存在不表达状态不表达状态表达水平不足以引起细胞的恶性转化表达水平不足以引起细胞的恶性转化癌基因：定位功能癌基因，产物分泌蛋白生长因子sisPDGF链
10、跨膜蛋白受体型酪氨酸激酶erbB2,EGF样受体erbB,EGF受体fms,CSF-1受体膜结合蛋白G-蛋白非受体型酪氨酸激酶rasp21rassrcpp60src胞浆可溶性蛋白非受体型酪氨酸激酶丝氨酸/苏氨酸激酶信号转导连接蛋白Raf，ab1crk,SH2/SH3调节蛋白vav,SH2调节蛋白胞核蛋白转录因子Myb，mycfosjunerbA,T3受体表1细胞癌基因按其产物定位和功能分类能能 够够 抑抑 制制 细细 胞胞 恶恶 性性 转转 化化 或或 抑抑 制制 细细 胞胞 异异 常常 增殖的基因增殖的基因 目前研究较多的有目前研究较多的有p53p53基因、基因、pRBpRB基因、基因、p1
11、6p16蛋白、蛋白、p15p15蛋白、蛋白、p21p21等。等。抑癌基因基因基因染色体定位染色体定位相关肿瘤相关肿瘤基因产物及功能基因产物及功能RBRB13q1413q14RBRB、成骨肉瘤、胃癌、成骨肉瘤、胃癌、SCLCSCLC、乳癌、结肠癌、乳癌、结肠癌p105p105，控制生长，控制生长WTWT11p1311p13WTWT、横纹肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母细胞瘤WT-ZFPWT-ZFP，负调控转录因子，负调控转录因子NF-1NF-117p1217p12神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、雪旺氏细胞瘤、神经纤维肉瘤神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、雪旺氏细胞瘤、神
12、经纤维肉瘤GAPGAP，拮抗，拮抗p21rasBp21rasBDCCDCC18q21.318q21.3结肠瘤结肠瘤P192,P192,细胞粘附分子细胞粘附分子p53p5317p1317p13星星状状细细胞胞瘤瘤、胶胶质质母母细细胞胞瘤瘤、结结肠肠癌癌、乳乳癌癌、成成骨骨肉肉瘤瘤、SCLCSCLC、胃癌、磷状细胞肺癌、胃癌、磷状细胞肺癌P53 P53 控制肿瘤生长控制肿瘤生长erb Aerb A17q2117q21ANLLANLLT3T3受体，含锌指结构的转录因受体，含锌指结构的转录因表2已确定的几种抑癌基因野生型野生型P53P53生物学活性生物学活性当当DNADNA损伤的时候损伤的时候,P53
13、,P53基因就明显表达使细胞在基因就明显表达使细胞在G1G1期生长阻滞，促使细胞凋亡。期生长阻滞，促使细胞凋亡。抑制肿瘤细胞生长抑制肿瘤细胞生长保持保持DNADNA完整性完整性包 括 肿 瘤 转 移 促 进 基 因 或 肿 瘤 转 移 抑 制包 括 肿 瘤 转 移 促 进 基 因 或 肿 瘤 转 移 抑 制 基因基因。肿瘤转移相关基因肿瘤耐药基因其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。血小板衍生生长因子（血小板衍生生长因子（PDGFPDGF）表皮生长因子（表皮生长因子（EGFEGF）VGFVGF基因等基因等 肿瘤生长因子 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断目前主要
14、集中在以下几个方面：肿瘤转移标志物肿瘤抗药基因突变的癌基因肿瘤相关的病毒基因标志分类标志分类机制机制分子标志分子标志应用于癌症诊断应用于癌症诊断分子遗传性分子遗传性染色体易位染色体易位t(9t(9；22)22)，t t（1414；1818），），t(11t(11；12)12)等等白血病、淋巴瘤等白血病、淋巴瘤等点突变点突变p53,ER rasp53,ER ras等等胃胃癌癌、膀膀胱胱癌癌、乳乳腺腺癌癌、前前列列腺腺癌癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌等结肠癌、胰腺癌、肺癌等缺失缺失BRCA1BRCA1，BRCA2BRCA2，DCCDCC等等乳腺癌、结肠癌乳腺癌、结肠癌改变拼接改变拼接CD44CD44，m
15、uc-1,VLA-4muc-1,VLA-4等等结肠癌、肾癌、乳腺癌、脑瘤等结肠癌、肾癌、乳腺癌、脑瘤等扩增扩增erb-B2,EGFR,N-myc,raserb-B2,EGFR,N-myc,ras乳腺癌、脑瘤、神经母细胞瘤乳腺癌、脑瘤、神经母细胞瘤比例改变比例改变明胶酶明胶酶A/TIMP2A/TIMP2乳腺癌转移等乳腺癌转移等病毒性病毒性病毒转化病毒转化HPV,HCV,HBVHPV,HCV,HBV，EBVEBV宫颈癌、肝癌、鼻咽癌等宫颈癌、肝癌、鼻咽癌等组织性组织性组织分化组织分化PSA,PSMAPSA,PSMA前列腺癌前列腺癌muc-18,muc-18,酪氨酸酸酶，酪氨酸酸酶，Mage-3Ma
16、ge-3黑素瘤黑素瘤AFP,AFP,白蛋白白蛋白肝癌肝癌甲状腺球蛋白甲状腺球蛋白甲状腺癌甲状腺癌NPGP9.5NPGP9.5，酪氨酸羟化酶表面活性物质等，酪氨酸羟化酶表面活性物质等神经母细胞瘤神经母细胞瘤肿瘤性肿瘤性肿瘤细胞特征肿瘤细胞特征CEACEA肺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌结肠癌、胃癌、乳腺癌-HCG-HCG黑素瘤等黑素瘤等CK-19CK-19肺鳞癌肺鳞癌端粒酶端粒酶结肠癌、乳腺癌、头颈部癌等结肠癌、乳腺癌、头颈部癌等微卫星体等微卫星体等结肠癌、乳腺癌、头颈部癌等结肠癌、乳腺癌、头颈部癌等表表3 3 肿瘤基因诊断的分子标志及其应用肿瘤基因诊断的分子标志及其应用 可分为四大类可分为四大
17、类 I.I.组织特异性基因标志组织特异性基因标志 II.II.肿瘤特异性基因标志肿瘤特异性基因标志 III.III.血管生成因子血管生成因子 IV.IV.其它与肿瘤转移相关的分子及基质蛋白酶及其抑制剂其它与肿瘤转移相关的分子及基质蛋白酶及其抑制剂 肿瘤转移基因标志物组织特异性基因标志物指肿瘤组织和指肿瘤组织和/或起源正常组织所特有，在淋巴组织和血细胞或起源正常组织所特有，在淋巴组织和血细胞中不存在的。如角质蛋白家族（中不存在的。如角质蛋白家族（CKCK）mRNAmRNA、粘蛋白基因、表皮、粘蛋白基因、表皮生长因子受体（生长因子受体（EGFREGFR）mRNAmRNA等。等。存在于肿瘤及其起源的
18、正常细胞中，不存在于其他细胞。存在于肿瘤及其起源的正常细胞中，不存在于其他细胞。如如CEA mRNACEA mRNA、AFP mRNAAFP mRNA、PSA mRNAPSA mRNA等等血管生成因子如血管内皮细胞生长因子（如血管内皮细胞生长因子（VEGFVEGF）等。）等。突变的癌基因癌癌基基因因的的突突变变是是癌癌基基因因激激活活的的重重要要方方式式和和途途径径。除除了了见见到到较较大大范范围围片片段段的的缺缺失失或或插插人人以以及及染染色色体体转转位位之之外外，大大多多数数情情况况下下，都都是是少少数数核核苷苷酸酸或或单单个个碱碱基基的的突突变变。.癌基因点突变的检测癌基因点突变的检测
19、单单 链链 构构 象象 多多 态态 性性（S S S S C C P P）检检 测测 技技 术术 等等 .肿瘤相关的病毒基因EBEB病毒（病毒（EBVEBV）人乳头瘤病毒（人乳头瘤病毒（HPVHPV）乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBVHBV）、丙型肝炎病毒（）、丙型肝炎病毒（HCVHCV）感染）感染对于这些肿瘤组织细胞中相关病毒基因及其编码产物的检测，可以作为这些类型的肿瘤诊断的标志。致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们极大的关注致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们极大的关注肿瘤基因诊断的常用方法PCRPCR、RT-PCRRT-PCRSouthern blotSouthern blot杂交技术
20、、杂交技术、Northern blotNorthern blot杂交技术杂交技术基因芯片基因芯片基因测序。基因测序。肿瘤基因的分子诊断意义肿瘤基因的分子诊断意义 1.1.肿瘤的早期诊断和筛选肿瘤的早期诊断和筛选2.2.肿瘤疗效监测肿瘤疗效监测 3.3.肿瘤的预后判断肿瘤的预后判断 4.4.肿瘤微转移检测肿瘤微转移检测 肿瘤基因检测在肿瘤微转移检测中肿瘤基因检测在肿瘤微转移检测中应用举例应用举例前列腺癌特异性基因前列腺癌特异性基因DD3DD3PCA3PCA3 DD3DD3PCA3PCA3是一种非编码是一种非编码RNARNA的基因，定位于的基因，定位于9q219q212222染色体。它为前列腺癌特
21、异性基因之一，染色体。它为前列腺癌特异性基因之一，DD3DD3PCA3PCA3 mRNAmRNA仅在前列腺癌细胞中表达，而在其它正常组织和癌组织以及细胞系中均不表达。仅在前列腺癌细胞中表达，而在其它正常组织和癌组织以及细胞系中均不表达。DD3mRNA14外显子扩增结果M：50bpDNALadder；1：LNCaP阳性对照；23：PCa；4：PIN(前列腺上皮内瘤变)；56：BPH(前列腺增生)；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19
22、：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。DD3mRNA13外显子扩增结果M：50bpDNALadder；1：LNCaP阳性对照；23：PCa；4：PIN；56：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。DD3mRNA34外显子扩增结果M：50bpDNALadder；1：LNCaP阳性对照；23：PCa；4：PIN；56
23、：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。前列腺组织和其他肿瘤组织及癌旁组织DD3mRNA检测结果 M：50bpDNA标准；1：LNCaP阳性对照；2：BPH；3：健康男性志愿者；410为PCa；11为试剂空白。外周血DD3mRNA的RT-PCR扩增电泳图RT-PCR检测结果 v4444例例PCaPCa组中组中1313例可见例可见DD3 mRNADD3
24、 mRNA阳性结果阳性结果(其中其中B B期、期、C C期及期及D D期分别期分别有为有为0 0例、例、2 2例，例，1111例例)。v3030例例BPHBPH患者和患者和1818名健康男性志愿者标本中均未检出名健康男性志愿者标本中均未检出DD3 mRNADD3 mRNA。外周血DD3mRNA的巢式RT-PCR扩增电泳图 M：50bpDNA分子量标准；1：LNCaP阳性对照；2：阴性对照(女性)；3：BPH患者；4：健康男性志愿者；58：未治疗的PCa；9：试剂空白巢式RT-PCR检测结果v4444例例PCaPCa组中组中2121例可见例可见DD3 mRNADD3 mRNA阳性结果阳性结果(其
25、中其中B B期、期、C C期、期、D D期分期分别有别有1 1例、例、5 5例、例、1515例例)v3030例例BPHBPH患者和患者和1818名健康男性志愿者均未见阳性结果名健康男性志愿者均未见阳性结果 两种方法对PCa患者外周血DD3mRNA检出率比较RT-PCR巢式巢式RT-PCR+-+130-823注：注：2 2=20.2=20.2，P P0.0010.001；KappaKappa0.6290.629，P P0.0010.001 外周血DD3mRNA巢式RT-PCR方法的灵敏度M:50bpDNA分子量标准；16:依次为105、104、103、102、101、1个LNCaP细胞/ml全血
26、；7:阴性对照；8:试剂空白组别组别 DD3 mRNADD3 mRNA检出率检出率(%(%，例数，例数)PCaPCa（未治疗）（未治疗）100%100%（11/1111/11）BPHBPH 0%0%（0/300/30）健康男性志愿者健康男性志愿者（对照）（对照）0%0%（0/180/18）注：经卡方检验，注：经卡方检验，2 259.0 59.0 P P0.010.01不同前列腺疾病患者其外周血DD3mRNA检出率比较巢式巢式RT-PCRRT-PCRPCa不同临床分期未治疗组和治疗组DD3mRNA阳性率比较(%,例数)临床分期临床分期 DD3 mRNADD3 mRNA未治疗组未治疗组 内分泌治疗组内分泌治疗组 B B期期 100.0(1/1)100.0(1/1)0.00.0（0/20/2）C C期期 100.0(3/3)100.0(3/3)25.025.0（2/82/8）*D D期期 100.0(7/7)100.0(7/7)34.8(8/23)*34.8(8/23)*合计合计 100.0(11/11)100.0(11/11)30.3(10/33)*30.3(10/33)*注：内分泌治疗组与未治疗组比较，注：内分泌治疗组与未治疗组比较，*P P0.050.05，*P P0.010.01巢式巢式RT-PCRRT-PCR谢 谢!