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1、液相色谱分配离子交液相色谱分配离子交换凝胶换凝胶第1页，本讲稿共29页一、基本原理一、基本原理1、吸附色谱的局限性、吸附色谱的局限性（1）吸附色谱不适合于分离强极性的亲水性）吸附色谱不适合于分离强极性的亲水性物质（成分）；物质（成分）；（2）吸附剂的含水量对吸附剂的吸附能力影）吸附剂的含水量对吸附剂的吸附能力影响较大，常使结果重现性较差；响较大，常使结果重现性较差；（3）易出现拖尾峰。）易出现拖尾峰。第2页，本讲稿共29页 2 2、分配色谱原理、分配色谱原理（1 1）固定相为液体）固定相为液体）固定相为液体）固定相为液体 将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为将某种溶剂涂
2、布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为固定相固定相固定相固定相。吸附剂颗粒表面或纸纤维叫吸附剂颗粒表面或纸纤维叫吸附剂颗粒表面或纸纤维叫吸附剂颗粒表面或纸纤维叫载体或担体载体或担体载体或担体载体或担体。根据组分在两相中的根据组分在两相中的根据组分在两相中的根据组分在两相中的溶解度不同溶解度不同溶解度不同溶解度不同而分离。而分离。而分离。而分离。（2 2）“相似相溶相似相溶相似相溶相似相溶”原则原则原则原则 极性物质在极性溶剂中溶解度大，极性物质在极性溶剂中溶解度大，
3、极性物质在极性溶剂中溶解度大，极性物质在极性溶剂中溶解度大，K K大；大；大；大；非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，K K大。大。大。大。（3 3）分配定律与分配等温线）分配定律与分配等温线）分配定律与分配等温线）分配定律与分配等温线（4 4）分配色谱的特点：）分配色谱的特点：）分配色谱的特点：）分配色谱的特点：a a、重现性、重现性、重现性、重现性 b b、峰对称、峰对称、峰对称、峰对称 c c、无强烈滞留现象、无强烈滞留现象、无强烈滞留现象、无强烈滞留现象.几乎适用于各种类型的化合物，特别
4、适宜于亲水性物质，如极性较大的生物几乎适用于各种类型的化合物，特别适宜于亲水性物质，如极性较大的生物几乎适用于各种类型的化合物，特别适宜于亲水性物质，如极性较大的生物几乎适用于各种类型的化合物，特别适宜于亲水性物质，如极性较大的生物碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等。碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等。碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等。碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等。第3页，本讲稿共29页二、载体只起负载固定相的作用。只起负载固定相的作用。要求：惰性、无吸附能力、纯净、颗粒要求：惰性、无吸附能力、纯净、颗粒均匀。均匀。种类种类 1）硅胶：重现性差）硅胶：重现性差
5、2）硅藻土：应用最多）硅藻土：应用最多 3）纤维素：纸色谱）纤维素：纸色谱第4页，本讲稿共29页三、固定相和流动相的选择 正相分配色谱：正相分配色谱：正相分配色谱：正相分配色谱：固定相的极性固定相的极性固定相的极性固定相的极性大于大于大于大于流动相的极性；流动相的极性；流动相的极性；流动相的极性；固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱。按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱。按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱。按一
6、定的比例与载体混匀后填装于色谱柱。流动相：石油醚等流动相：石油醚等流动相：石油醚等流动相：石油醚等洗脱顺序洗脱顺序:极性大极性大的组分的组分保留作用强保留作用强；极性小；极性小的组分保留作用弱的组分保留作用弱 第5页，本讲稿共29页反相分配色谱反相分配色谱：固定相的极性：固定相的极性小于小于流动相的流动相的极性。极性。固定液：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶固定液：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂。剂。流动相：水、各种水溶液（酸、碱、盐及缓冲流动相：水、各种水溶液（酸、碱、盐及缓冲液）、与水混合的有机溶剂。液）、与水混合的有机溶剂。洗脱顺序洗脱顺序:极性小极性小的组分的组分保留作用强保留作用
7、强；极性大的；极性大的组分保留作用弱组分保留作用弱第6页，本讲稿共29页四、分配色谱操作注意事项四、分配色谱操作注意事项1、两相溶剂的处理、两相溶剂的处理2 2、上样量与样品前处理。、上样量与样品前处理。3 3、柱色谱、柱色谱、柱色谱、柱色谱4 4、纸色谱、纸色谱、纸色谱、纸色谱第7页，本讲稿共29页第三节第三节 离子交换色谱法离子交换色谱法(ion exchange chromatography)一、基本原理一、基本原理1、离子交换剂与离子交换过程、离子交换剂与离子交换过程（1 1）离子交换剂）离子交换剂）离子交换剂）离子交换剂 为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗粒，为一种固体状可在
8、水溶液中浸润和溶胀的多孔颗粒，为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗粒，为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗粒，其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，有一种其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，有一种其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，有一种其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，有一种离子可在水中自由移动，而另一种则在固定相上不能离子可在水中自由移动，而另一种则在固定相上不能离子可在水中自由移动，而另一种则在固定相上不能离子可在水中自由移动，而另一种则在固定相上不能自由移动。自由移动。自由移动。自由移动。可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即离可自由移动的离子可以被其它
9、同类离子置换，即离可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即离可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即离子交换。子交换。子交换。子交换。第8页，本讲稿共29页（2）离子交换过程）离子交换过程）离子交换过程）离子交换过程 水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子交换水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子交换水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子交换水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子交换树脂上固定的离子基团结合，使原来与其结合的离树脂上固定的离子基团结合，使原来与其结合的离树脂上固定的离子基团结合，使原来与其结合的离树脂上固定的离子基团结合，使原来与其结合的离子被置换，进入流动相而发生
10、置换。子被置换，进入流动相而发生置换。子被置换，进入流动相而发生置换。子被置换，进入流动相而发生置换。带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧酸基）：带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧酸基）：带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧酸基）：带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧酸基）：用于阳离子分离；用于阳离子分离；用于阳离子分离；用于阳离子分离；带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：用于阴离子带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：用于阴离子带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：用于阴离子带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：用于
11、阴离子分离。分离。分离。分离。第9页，本讲稿共29页2、分离机理、分离机理（1 1）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移。固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移。固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移。固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移。（2 2）离子交换平衡：）离子交换平衡：）离子交换平衡：）离子交换平衡：K K K K 大，大，大，大，Na+Na+Na+Na+易与固定相结合，移动慢；易与固定相结合，移动慢；易与固
12、定相结合，移动慢；易与固定相结合，移动慢；反之，移动快。反之，移动快。反之，移动快。反之，移动快。t tR R=t=tmm(1+K)(1+K)V VR R=V=Vmm(1+K)=V(1+K)=Vmm+KV+KVS SKKKK为分配系数为分配系数为分配系数为分配系数平衡时平衡时平衡时平衡时 K 为选择性系数为选择性系数 （交换平衡常数）（交换平衡常数）第10页，本讲稿共29页二、离子交换树脂二、离子交换树脂1 1、离子交换树脂的构成、离子交换树脂的构成 由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，不溶于水和有机由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，不溶于水和有机由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结
13、构，不溶于水和有机由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，不溶于水和有机溶剂，性质稳定。溶剂，性质稳定。溶剂，性质稳定。溶剂，性质稳定。苯乙烯组成长链；苯乙烯组成长链；苯乙烯组成长链；苯乙烯组成长链；二乙烯基苯为交联剂二乙烯基苯为交联剂二乙烯基苯为交联剂二乙烯基苯为交联剂 第11页，本讲稿共29页2、离子交换树脂的类型、离子交换树脂的类型（1）阳离子交换树脂）阳离子交换树脂 可交换的离子为阳离子。可交换的离子为阳离子。氢型、钠型氢型、钠型氢型、钠型氢型、钠型 强酸型、弱酸型、中强酸型（强酸型、弱酸型、中强酸型（强酸型、弱酸型、中强酸型（强酸型、弱酸型、中强酸型（COOHCOOH、POPO3 3
14、H H、SHSH）例如：磺酸型例如：磺酸型例如：磺酸型例如：磺酸型 R-SOR-SO3 3H H+(pH (pH范围宽范围宽范围宽范围宽)*应注意应注意应注意应注意pHpH范围，否则交换容量急剧下降。范围，否则交换容量急剧下降。范围，否则交换容量急剧下降。范围，否则交换容量急剧下降。（2）阴离子交换树脂）阴离子交换树脂 可交换的离子为阴离子。可交换的离子为阴离子。按不同碱性分：按不同碱性分：按不同碱性分：按不同碱性分：强碱型（季胺基团）强碱型（季胺基团）强碱型（季胺基团）强碱型（季胺基团）NRNR3 3+(pH11)(pH11)NHNH2 2,NHR,NHR,NRNR2 2等等等等 (pH8)
15、(pH B B3+3+C C2+2+D D+大分子量的有机离子大分子量的有机离子,有较高的亲和力有较高的亲和力 第15页，本讲稿共29页四、流动相四、流动相1 1、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定的、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定的、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定的、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定的pHpH值）。值）。值）。值）。2 2、对分离的影响、对分离的影响第16页，本讲稿共29页2、对分离的影响、对分离的影响流动相主要影响组分离子和交换基团形成离子对流动相主要影响组分离子和交换基团形成离子对的过程的过程 pH对弱酸、弱碱的影响对弱酸、弱碱的影响 影响其离解平衡，即
16、控制了组分形成离子的程度：影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程度：影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程度：影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程度：离子离子离子离子 组分组分组分组分，则，则，则，则KK；离子离子离子离子 组分组分组分组分，则，则，则，则K K 不同离子交换剂的不同离子交换剂的不同离子交换剂的不同离子交换剂的pHpH适用范围：适用范围：适用范围：适用范围：强酸型：较宽强酸型：较宽强酸型：较宽强酸型：较宽;强碱型：强碱型：强碱型：强碱型：pH11;pH6;:pH6;弱碱型：弱碱型：弱碱型：弱碱型：pH8pH20002000）第21页，本讲稿共29页一、基本原理一、基本原
17、理一、基本原理一、基本原理 1 1、分离机理、分离机理、分离机理、分离机理（1 1）前三种是亲和力不同而分离；）前三种是亲和力不同而分离；）前三种是亲和力不同而分离；）前三种是亲和力不同而分离；（2 2）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根据分子量大小来分离；据分子量大小来分离；据分子量大小来分离；据分子量大小来分离；（3 3）凝胶）凝胶）凝胶）凝胶 有一定的孔径分布范围的多孔物质。组分有一定的孔径分布范围的多孔物质。组分有一定的孔径分布范围的多孔物质。组分
18、有一定的孔径分布范围的多孔物质。组分进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决于进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决于进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决于进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决于孔和组分分子的大小。孔和组分分子的大小。孔和组分分子的大小。孔和组分分子的大小。小分子小分子小分子小分子:将全部渗入细孔中将全部渗入细孔中将全部渗入细孔中将全部渗入细孔中,在流经柱时在流经柱时在流经柱时在流经柱时,经历的路程最长经历的路程最长经历的路程最长经历的路程最长.中等大小分子中等大小分子中等大小分子中等大小分子:渗入部分较大的孔隙渗入部分较大的孔隙渗入部分较大的
19、孔隙渗入部分较大的孔隙,而被较小的孔隙排斥而被较小的孔隙排斥而被较小的孔隙排斥而被较小的孔隙排斥,经历经历经历经历的路程居中的路程居中的路程居中的路程居中.大分子大分子大分子大分子:完全被排斥在空隙外完全被排斥在空隙外完全被排斥在空隙外完全被排斥在空隙外,经历的路程最短经历的路程最短经历的路程最短经历的路程最短.第22页，本讲稿共29页所以洗脱次序仅是分子大小所以洗脱次序仅是分子大小(分子量分子量)的函数。的函数。的函数。的函数。分子大小受分子量分子大小受分子量分子大小受分子量分子大小受分子量,分子几何形状（环球形、螺旋分子几何形状（环球形、螺旋分子几何形状（环球形、螺旋分子几何形状（环球形、
20、螺旋形或棒形）组分分子间的缔合程度、组分与流动相形或棒形）组分分子间的缔合程度、组分与流动相形或棒形）组分分子间的缔合程度、组分与流动相形或棒形）组分分子间的缔合程度、组分与流动相分子间的缔合程度有关分子间的缔合程度有关分子间的缔合程度有关分子间的缔合程度有关。第23页，本讲稿共29页Size Exclusion Chromatography第24页，本讲稿共29页2 2、分配系数和保留值、分配系数和保留值、分配系数和保留值、分配系数和保留值(1)(1)分配系数分配系数分配系数分配系数K K 组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内组分进入柱
21、子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内扩散，扩散平衡时扩散，扩散平衡时扩散，扩散平衡时扩散，扩散平衡时 a a、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在孔、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在孔、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在孔、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在孔隙外。隙外。隙外。隙外。C CS S=C=Cmm K=1 K=1 b b、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥在固、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥在固、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥在固、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥在
22、固定相孔隙之外定相孔隙之外定相孔隙之外定相孔隙之外 C CS S=0 K=0=0 K=0 c c、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，0K1 0K1 所以在凝胶色谱中所以在凝胶色谱中所以在凝胶色谱中所以在凝胶色谱中 0K1 0K1第25页，本讲稿共29页（2）保留值）保留值 保留方程保留方程保留方程保留方程 V VR R=V=Vm m+KV+KVS S 在凝胶色谱中在凝胶色谱中在凝胶色谱中在凝胶色谱中 V Vmm：外水体积（：外水体积（：外水体积（：外水体积（V V
23、0 0）V VS S：内水体积（：内水体积（：内水体积（：内水体积（V Vi i）当当当当 K=1 K=1 时，时，时，时，V VR R V Vm m V VS SV V0 0V Vi i K=0 K=0 时，时，时，时，V VR R V Vm m V V0 0 所以，所有组分均在所以，所有组分均在所以，所有组分均在所以，所有组分均在 （V Vi i+V+V0 0）体积内流出体积内流出体积内流出体积内流出。第26页，本讲稿共29页二、凝胶类型二、凝胶类型 （自学）（自学）1、葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶2、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶3、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶4、多孔玻璃凝胶、多孔玻璃凝胶 14
24、用于亲水性样品的分离用于亲水性样品的分离5、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品亲脂性）亲脂性）第27页，本讲稿共29页三、实验条件的选择三、实验条件的选择 分子量较正曲线分子量较正曲线分子量较正曲线分子量较正曲线 将分子量不同的组分混合物将分子量不同的组分混合物将分子量不同的组分混合物将分子量不同的组分混合物注入柱子，经分离后，分别注入柱子，经分离后，分别注入柱子，经分离后，分别注入柱子，经分离后，分别测得它们的保留体积，以分测得它们的保留体积，以分测得它们的保留体积，以分测得它们的保留体积，以分子量对保留体积作图，得一子量对保留体积作图，得一子量对保留体积作图，得一子量对
25、保留体积作图，得一曲线，称分子量校正曲线。曲线，称分子量校正曲线。曲线，称分子量校正曲线。曲线，称分子量校正曲线。图中，图中，图中，图中，A A、B B两点反映了该固两点反映了该固两点反映了该固两点反映了该固定相能够分离的组分分子量定相能够分离的组分分子量定相能够分离的组分分子量定相能够分离的组分分子量的上限的上限的上限的上限(排斥极限排斥极限排斥极限排斥极限)、下限、下限、下限、下限(全全全全渗透极限渗透极限渗透极限渗透极限)，只有分子量在，只有分子量在，只有分子量在，只有分子量在A A、B B对应量之间的组分才能被对应量之间的组分才能被对应量之间的组分才能被对应量之间的组分才能被分离。分离
26、。分离。分离。1 1、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）第28页，本讲稿共29页2 2、凝胶的溶胀、凝胶的溶胀、凝胶的溶胀、凝胶的溶胀 干凝胶干凝胶干凝胶干凝胶+10+10倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；注意：时间足够长，不易过稀。注意：时间足够长，不易过稀。注意：时间足够长，不易过稀。注意：时间足够长，不易过稀。3 3、装柱：不应有气泡。、装柱：不应有气泡。、装柱：不应有气泡
27、。、装柱：不应有气泡。柱长柱长柱长柱长100cm100cm4 4、样品的制备、样品的制备、样品的制备、样品的制备 组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的252530%30%。K K值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的2 25 5。5 5、洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同。、洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同。、洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同。、洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同。洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同pHpH的缓冲液、水的缓冲液、水的缓冲液、水的缓冲液、水有机溶剂混合液。有机溶剂混合液。有机溶剂混合液。有机溶剂混合液。6 6、应用：测定大分子物质的分子量（如、应用：测定大分子物质的分子量（如、应用：测定大分子物质的分子量（如、应用：测定大分子物质的分子量（如PrPr）第29页，本讲稿共29页