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1、1964-1970 1964-1970 发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式:逆转录逆转录 19531953年年,Watson,Watson和和CrickCrick提出中心法则提出中心法则:遗传信息的单向流动。遗传信息的单向流动。中心法则中心法则:病毒（复制）病毒（复制）复制复制转录转录DNA RNA 蛋白质蛋白质翻译逆转录逆转录RNARNA的复制存在于的复制存在于RNARNA病毒病毒 DNA DNA是生物遗传的主要物质基础是生物遗传的主要物质基础,生物机体的遗传信息以密码生物机体的遗传信息以密码的形式编码在的形式编码在DNADNA分子上分子上,表现为特定的核苷
2、酸排列顺序表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过并通过DNADNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中,遗传遗传信息自信息自DNADNA转录给转录给RNA,RNA,然后翻译成特异的蛋白质然后翻译成特异的蛋白质,以执行各种生以执行各种生命功能命功能,使后代表现出与亲代相似的遗传性状。使后代表现出与亲代相似的遗传性状。复制复制:以亲代以亲代DNADNA为模板为模板,根据根据碱基配对的原则碱基配对的原则,在一系列酶的作用下在一系列酶的作用下,生成与亲代相同的子代生成与亲代相同的子代DNADNA的过程。的过程。几个基本概念几个基本概念:逆转录逆转录:
3、以以RNARNA为模板为模板,在在逆转录酶逆转录酶的作用下的作用下,生生成成DNADNA的过程。的过程。翻译翻译:亦叫转译亦叫转译,以以mRNAmRNA为模板为模板,将将mRNAmRNA的密码解的密码解读成蛋白质的读成蛋白质的氨基酸顺序氨基酸顺序的过程。的过程。转录转录:以以DNADNA为模板为模板,按照碱基配对原则合成按照碱基配对原则合成RNA,RNA,即将即将DNADNA所含的遗传信息传给所含的遗传信息传给RNA,RNA,形成一条形成一条与与DNADNA链互补的链互补的RNARNA的过程。的过程。一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制2.2.半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据:
4、1.1.定义定义:1958 1958年年MeselsonMeselson和和StahlStahl用同位素用同位素1515N N标记标记大大肠杆菌肠杆菌DNADNA,首先证明了首先证明了DNADNA的半保留复制。的半保留复制。以以亲代亲代DNADNA双链双链为模板以为模板以碱基互补碱基互补方式合成子方式合成子代代DNA,DNA,这样新形成的子代这样新形成的子代DNADNA中中,一条链来自亲代一条链来自亲代DNA,DNA,而另一条链则是新合成的而另一条链则是新合成的,这种复制方式叫这种复制方式叫半保留复制半保留复制。DNADNA半保留复制图示半保留复制图示:双向复制双向复制单向复制单向复制二、二、
5、DNADNA复制的起点与方向复制的起点与方向四、与四、与DNADNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质(一一)DNADNA聚合酶聚合酶:19561956年年KornbergKornberg等在大肠杆菌中首等在大肠杆菌中首先发现先发现DNADNA聚合酶聚合酶,其后发现该酶在许多生物中广泛其后发现该酶在许多生物中广泛存在。存在。(二二)大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶(1)(1)5 5 3 3 聚合酶聚合酶功能功能(但持续合成但持续合成DNADNA的能力差的能力差););(2)(2)3 3 5 5外切酶外切酶活性活性(对双链无作用对双链无作用,在正常聚合条件在正常聚合条件下下,此活性
6、不能作用于生长链此活性不能作用于生长链,只作用于生长中不配对的单只作用于生长中不配对的单链链,校对功能。校对功能。););(3)(3)还具有还具有5 5 33外切酶外切酶活性活性(双链有效双链有效););1 1、DNADNA聚合酶聚合酶:19561956年年KornbergKornberg首先从首先从大肠杆菌大肠杆菌中分中分离。该酶为单体酶离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶含一个锌原子。为多功能酶,具有具有:该酶缺失时大肠杆菌仍具有该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNADNA合成酶活性合成酶活性,只是对只是对DNADNA损伤的修复能力损伤的修复能力下降下降,容易导致变异和死亡。推测该容易导致变
7、异和死亡。推测该酶主要是对酶主要是对DNADNA损伤的修复损伤的修复,以及在以及在DNADNA复制时复制时RNARNA引物切引物切除及其缺口的填补。除及其缺口的填补。2 2、DNADNA聚合酶聚合酶:多亚基酶多亚基酶,聚合作用聚合作用,聚合活力比聚合活力比DNADNA聚合聚合酶酶高高;持续合成持续合成DNADNA的能力差。该酶缺失时的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有大肠杆菌仍具有DNADNA合成能力合成能力,推测该酶仍然推测该酶仍然不是真正的不是真正的DNADNA聚合酶。该酶聚合酶。该酶具有具有33 5 5外切酶活性外切酶活性。其功能可能在。其功能可能在修复紫外光引起修复紫外光引起的的DNAD
8、NA损伤损伤中起作用。中起作用。(三三)DNA)DNA连接酶连接酶:连接连接DNADNA双链中的单链切口双链中的单链切口作用特点作用特点:大肠杆菌和其它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNADNA连接酶连接酶要求要求NADNAD+提供能量提供能量;在高等生物和噬菌体中在高等生物和噬菌体中,则则要求要求ATPATP提供能量。提供能量。DNA DNA连接酶连接酶在在DNADNA复制、损伤修复、重组复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。等过程中起重要作用。(四四)与与DNADNA合成有关的其它蛋白因子合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中大肠杆菌中)蛋白质蛋白质功能功能相对分子量相对分子量（10103 3）
9、拓扑异构酶拓扑异构酶DNADNA解链酶解链酶 单链结合蛋白单链结合蛋白引物合成酶引物合成酶 DNA DNA聚合酶聚合酶引入或松开超螺旋引入或松开超螺旋 使双链使双链DNADNA解链解链稳定单链区稳定单链区合成合成RNARNA引物引物除去引物并填满缺口除去引物并填满缺口4004006565747460601091092 2、解螺旋酶、解螺旋酶 (解链酶解链酶)通过水解通过水解ATPATP将将DNADNA两条链打开两条链打开。稳定稳定DNADNA解开的单链解开的单链,防止复性和保护单链部分防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。不被核酸酶水解。3 3、单链结合蛋白、单链结合蛋白:4 4、引物合成酶、
10、引物合成酶催化引物催化引物RNARNA的生成的生成(五五)、参与、参与DNA复制的复制的酶与蛋白因酶与蛋白因子总览图子总览图复制原点复制原点oriC和原点的识别和原点的识别:DNADNA的复制有特定的起始位点的复制有特定的起始位点,叫做叫做复制原点复制原点。常用。常用oriori C(C(或或o)o)表示。表示。复制原点复制原点由由DnaADnaA蛋白识别蛋白识别,在原点由解螺旋酶将双螺旋在原点由解螺旋酶将双螺旋解开成单链状态解开成单链状态,分别作为模板分别作为模板,合成其互补链合成其互补链(DNADNA双链双链的解开还需的解开还需DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶 、SSB),SSB),在原点
11、处形成一在原点处形成一个眼状结构个眼状结构,叫叫复制眼复制眼。五、五、DNADNA的复制过程的复制过程:(以大肠杆菌为例以大肠杆菌为例)(一一)复制起始复制起始1 1、拓扑异构酶解开超螺旋。、拓扑异构酶解开超螺旋。2 2、Dna ADna A蛋白识别起始位点。蛋白识别起始位点。3 3、解螺旋酶解开、解螺旋酶解开DNADNA双链。双链。4 4、单链结合蛋白结合于单链。、单链结合蛋白结合于单链。5 5、引物合成酶开始合成、引物合成酶开始合成RNARNA引物。引物。在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下的催化下,以四种以四种5-5-脱氧核苷三磷脱氧核苷三磷酸为底物酸为底物,在在RNARNA引物的引物的
12、33端以磷酸二酯键连接上脱端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。磷酸。DNADNA链的延伸同时进链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。两条链方向相反。前导链前导链 滞后链滞后链 冈崎片段冈崎片段 半不连续复制半不连续复制冈冈崎崎模模型型(二二)链的延长链的延长(三三)复制的终止复制的终止顺时针终止陷阱顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱逆时针终止陷阱 Ter:Ter:终止陷阱终止陷阱,引起复制终止的特定区域引起复制终止的特定区域,20bp,20bp的序列的序列,终止利终止利用物质用物质TusTus可识别并结合可识别并结合,从而导
13、致从而导致DNADNA复制的终止。复制的终止。六、真核生物六、真核生物DNADNA复制复制的特点的特点4 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制开始复制;而在快速生长的原核生物染色体而在快速生长的原核生物染色体DNADNA复制复制中中,起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时,往往采用往往采用更多的复制起点更多的复制起点。1 1、真核生物染色体有多个复制起点真核生物染色体有多个复制起点,称为称为自主复制自主复制序列序列(ARS)(ARS)或复制基因或复制基因(replicator);replica
14、tor);多复制眼多复制眼,呈呈双向复制双向复制,多复制子。多复制子。2 2、冈崎片段长冈崎片段长200200bpbp。3 3、真核生物真核生物DNADNA复制速度复制速度比原核比原核慢慢,速度为速度为1000100030003000bp/min(bp/min(仅为原核生物的仅为原核生物的1/201/201/501/50)。5 5、真核生物有真核生物有多种多种DNADNA聚合酶聚合酶,DNADNA聚合酶聚合酶()是真是真正的复制酶。正的复制酶。6 6、真核生物线性染色体两端有真核生物线性染色体两端有端粒结构端粒结构,它是由许多它是由许多成串的重短复序列组成成串的重短复序列组成,端粒功能是稳定染
15、色体末段端粒功能是稳定染色体末段结构结构,防止染色体间的末端连接防止染色体间的末端连接,并可补偿滞后链并可补偿滞后链5-5-末段在消除末段在消除RNARNA引物后造成的空缺引物后造成的空缺,使染色体使染色体保持保持一定一定长度长度。端粒酶端粒酶是含一段是含一段RNARNA的逆转录酶的逆转录酶.修复机制修复机制1、光复活修复、光复活修复T TT T紫外线紫外线紫外线紫外线(260nm)(260nm)T(胸腺嘧啶胸腺嘧啶)二聚体二聚体双键打开双键打开双键打开双键打开紫外光紫外光紫外光紫外光T-TT-T二聚体二聚体二聚体二聚体可见光激活该可见光激活该可见光激活该可见光激活该酶酶酶酶只有高等哺乳动物该
16、功能退化掉了。只有高等哺乳动物该功能退化掉了。例例 对细菌紫外诱变或杀灭时尽量保持暗环境。对细菌紫外诱变或杀灭时尽量保持暗环境。光复活酶结合于损伤部位光复活酶结合于损伤部位光复活酶结合于损伤部位光复活酶结合于损伤部位3.重组修复重组修复复制同时的修复复制同时的修复复制复制复制复制DNADNA聚合酶、连接酶补缺聚合酶、连接酶补缺聚合酶、连接酶补缺聚合酶、连接酶补缺提问提问提问提问:原损伤部位没有修复原损伤部位没有修复原损伤部位没有修复原损伤部位没有修复,对后代影响大吗对后代影响大吗对后代影响大吗对后代影响大吗?在后代中只有一个个体含有该条在后代中只有一个个体含有该条DNA,后代越后代越多多,影响
17、比例越小影响比例越小,等于消除影响。等于消除影响。八、逆转录八、逆转录(reverse transcription)(reverse transcription)19701970年年TeminTemin等等和和BaltimoreBaltimore分别从劳氏肉瘤病毒分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病和小白鼠白血病病毒等致病RNARNA病毒中分离出逆转录病毒中分离出逆转录酶酶,迄今已知的致癌迄今已知的致癌RNARNA病毒都含有逆转录酶。病毒都含有逆转录酶。定义定义:以以RNARNA为模板为模板,按照按照RNARNA中的核苷酸顺序合成中的核苷酸顺序合成DNADNA的过程的过程称为逆转录称为逆
18、转录,由逆转录酶催化进行。由逆转录酶催化进行。单链病毒单链病毒RNA RNA-DNARNA RNA-DNA杂交分子杂交分子 双链双链DNA(DNA(前病毒前病毒)逆转录酶也和逆转录酶也和DNADNA聚合酶一样聚合酶一样,沿沿5 533方向合成方向合成DNA,DNA,底物为四种底物为四种dNTP,dNTP,并要求短链并要求短链RNARNA作引物。作引物。逆转录酶是多功能酶逆转录酶是多功能酶,兼有兼有3 3种酶的活性种酶的活性:RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性;核糖核酸酶核糖核酸酶H H的活性的活性,专一水解专一水解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中杂交分子中的的RNA
19、,RNA,可沿可沿5533方向起核酸外切酶的作用方向起核酸外切酶的作用;DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性;无校对功能无校对功能,错误率高错误率高,易产生变异。易产生变异。+RNA+RNA+DNA-DNA-RNA+RNA+DNA-DNA-DNA+DNA+致癌致癌RNARNA病毒的逆转录过程病毒的逆转录过程 不能把不能把“中心法则中心法则”绝对化绝对化,遗传信息也可以从遗传信息也可以从RNARNA传递到传递到DNADNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究,为肿瘤为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学的防治提
20、供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。科的工具。19831983年年,发现人类免疫缺陷病毒发现人类免疫缺陷病毒(human immune human immune deficience virus,HIV),deficience virus,HIV),感染感染T T淋巴细胞后即杀死细胞淋巴细胞后即杀死细胞,造成造成宿主机体免疫系统损伤宿主机体免疫系统损伤,引起艾滋病引起艾滋病(acquired acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),immunodeficiency syndrome,AIDS),该病毒为该病毒为逆转录病毒。逆转录病毒。
21、逆转录酶发现的理论与实践意义逆转录酶发现的理论与实践意义:因发现逆转因发现逆转录病毒的遗传录病毒的遗传物质而获物质而获19751975年诺贝尔奖的年诺贝尔奖的三位科学家三位科学家DNADNA半保留复制图示半保留复制图示:DNADNA复制的半不连续性复制的半不连续性前导链前导链滞后链滞后链冈崎片段冈崎片段前导链前导链:以以3 5 方向的亲代方向的亲代链为模板连续合成的子代链。链为模板连续合成的子代链。滞后链滞后链:以以5 3方向的亲代方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段移动方向合成冈崎片段,再连再连接成滞后链。接成滞后链。参与参与DNA复复制的酶与蛋
22、制的酶与蛋白因子总览白因子总览图图 一、一、转录转录(transcription)transcription)以以DNADNA为模板为模板,根据碱基配对的原则合成与根据碱基配对的原则合成与DNADNA互补的互补的RNARNA的过程。的过程。1 1、相同点、相同点:都需要模板都需要模板 都以三磷酸核苷酸为底物都以三磷酸核苷酸为底物(NTP(NTP或或dNTP)dNTP)合成方向都是合成方向都是5353(一一)转录与转录与DNADNA复制的比较复制的比较:返回2 2、转录、转录DNADNA复制的不同点复制的不同点 模板链模板链:双链双链DNADNA中具有转录活性的的链称为模板链中具有转录活性的的链
23、称为模板链,又又称反义链称反义链(或负链或负链)。编码链编码链:双链双链DNADNA中无转录活性的链称为编码链中无转录活性的链称为编码链,又称有又称有义链义链(或正链或正链)。返回 转录不需引物转录不需引物;只转录只转录DNADNA分子中的一个片段分子中的一个片段(称为转录单位或操纵子称为转录单位或操纵子,operon);operon);双链双链DNADNA中只有一条链具有转录活性中只有一条链具有转录活性(称为模板链称为模板链););哪个基因被转录与特定的时间、空间、生理状态有关。哪个基因被转录与特定的时间、空间、生理状态有关。RNARNA聚合酶无校对功能。聚合酶无校对功能。(二二)DNA)D
24、NA指导下指导下RNARNA聚合酶聚合酶:1 1、RNARNA聚合酶聚合酶:催化性质催化性质 四种核苷三磷酸四种核苷三磷酸(ATP(ATP、GTPGTP、CTPCTP、UTP)UTP)为为底物底物;聚合酶无聚合酶无校对校对功能功能;转录时双链转录时双链局部局部解开解开,新生新生RNARNA链与模板链形成链与模板链形成杂螺杂螺旋旋,转录结束后转录结束后,DNA,DNA双螺旋恢复双螺旋恢复,RNA,RNA释放。释放。返回大肠杆菌的大肠杆菌的RNARNA聚合酶全酶聚合酶全酶由由5 5种亚基种亚基2 2组成组成,因子与其它部分的结合不是十分紧密因子与其它部分的结合不是十分紧密,它易于与它易于与2 2分
25、离分离,没有没有亚基的酶称为亚基的酶称为核心酶核心酶只催化只催化链的延长链的延长,对起始无作用。对起始无作用。称为称为起始因子起始因子。3 3、大肠杆菌的、大肠杆菌的RNARNA聚合酶聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌RNARNA聚合酶各亚基的功能聚合酶各亚基的功能a a亚基亚基解开前方的解开前方的DNADNA双螺旋、恢复后面的双螺旋、恢复后面的DNADNA双螺旋双螺旋b b亚基亚基催化磷酸二酯键的形成催化磷酸二酯键的形成b b亚基亚基与与DNADNA的非模板链结合的非模板链结合s s亚基亚基识别识别DNADNA上转录的起始部位上转录的起始部位,从而引导全从而引导全酶结合上去酶结合上去亚基组成亚基组成:
26、a a2 2bbbbws ws=a a2 2bbbbw w+s s 全酶全酶 核心酶核心酶酶酶类类分分布布产产物物-鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱对酶的作用对酶的作用分子量分子量反应条件反应条件I核仁核仁核质核质核质核质5.8SrRNA18SrRNA28SrRNAmRNAtRNA 5SrRNA不抑制不抑制低浓度抑制低浓度抑制高浓度抑制高浓度抑制500 000700 000700 000_低离子强度低离子强度,要要求求Mg2+或或Mn2+高离子强度高离子强度高高Mn2+浓度浓度4 4、真核细胞的、真核细胞的RNARNA聚合酶聚合酶同样同样,真核真核RNARNA聚合酶无校对功能。聚合酶无校对功能。(三三)大肠杆
27、菌的转录过程大肠杆菌的转录过程1 1、识别阶段、识别阶段:RNARNA聚合酶在聚合酶在亚基的引导下结合亚基的引导下结合于启动子上于启动子上;2 2、DNADNA双链局部解开双链局部解开;3 3、起始阶段、起始阶段:在模板链上通过碱基配对合成最初在模板链上通过碱基配对合成最初RNARNA链链;4 4、延伸阶段、延伸阶段:核心酶向前移动核心酶向前移动,RNA,RNA链不断生长链不断生长;5 5、终止阶段、终止阶段:RNARNA聚合酶到达终止子聚合酶到达终止子;6 6、RNARNA和和RNARNA聚合酶从聚合酶从DNADNA上脱落。上脱落。返回转录泡转录泡恢复螺旋恢复螺旋解螺旋解螺旋转录示意图转录示
28、意图(1)1)编码链编码链模板链模板链转录示意图转录示意图(2)(2)(四四)启动子与终止子启动子与终止子1 1、启动子、启动子(promotor):promotor):指指RNARNA聚合酶识别、结合和聚合酶识别、结合和开始转录的一段特定的开始转录的一段特定的DNADNA序列。序列。返回2 2、终止子、终止子(terminator)terminator)终止子终止子:提供转录终子信号的提供转录终子信号的DNADNA序列称为终止序列称为终止子子,有两类有两类:依赖依赖r r -因子的终止子和不依赖因子的终止子和不依赖r r -因子因子的终止子。的终止子。终止因子终止因子:协助协助RNARNA聚
29、合酶识别终止信号的辅助聚合酶识别终止信号的辅助因子因子(或蛋白质或蛋白质)。不依赖不依赖r r-因子的终因子的终止子止子:含富含富GCGC的回文序的回文序列和寡聚列和寡聚U U序列。序列。依赖依赖r r -因子的终因子的终止子的终止反应止子的终止反应:r r-因子因子:含六聚体含六聚体的的寡聚蛋白寡聚蛋白,具有依具有依赖赖RNARNA的的NTPNTP酶酶活性活性,它结合于新生它结合于新生RNARNA上上,借助与水解借助与水解NTPNTP产生产生能量推动能量推动RNARNA聚合酶聚合酶向前移动向前移动,当酶遭遇当酶遭遇终止子终止子时暂停前进时暂停前进,r r -因子追上酶因子追上酶,与与酶相互作
30、用释放酶相互作用释放RNARNA。还具有还具有RNA-DNARNA-DNA解螺解螺旋酶旋酶活性。活性。以真核生物为例以真核生物为例 转录初始产物转录初始产物(hnRNA)(hnRNA)1 1、mRNAmRNA前体的加工前体的加工返回二、二、RNA转录后的加工转录后的加工真核真核mRNAmRNA前体的加工步骤前体的加工步骤:(1)hnRNA(1)hnRNA被剪接被剪接,把内含子把内含子(DNA(DNA上非编码序列上非编码序列)转录转录序列剪掉序列剪掉,把外显子把外显子(DNA(DNA上的编码序列上的编码序列)转录序列转录序列)拼拼接上接上,真核生物一般为不连续基因。真核生物一般为不连续基因。加工
31、包括加工包括:(4)(4)分子内部的核苷酸甲基化修饰。分子内部的核苷酸甲基化修饰。(3)5(3)5端连接端连接“帽子帽子”结构结构(m(m7 7G G5 5 pppppp5 5 NmpNp-);NmpNp-);(2)3(2)3端添加端添加polyA“polyA“尾巴尾巴”;真核真核mRNA的的5“帽子帽子”加加工工多聚腺苷酸聚合酶多聚腺苷酸聚合酶 真核生物真核生物mRNAmRNA3 3-“-“尾巴尾巴”的的加工加工内切酶内切酶加尾信号加尾信号2 2、真核、真核rRNArRNA前体的加工前体的加工3 3、真核、真核tRNAtRNA前体的加工前体的加工 核酶的发现核酶的发现:19811981年年C
32、ech TCech T在研究在研究四膜虫四膜虫(Tetrahymena Tetrahymena thermophila)rRNAthermophila)rRNA前体拼接过程中发现前体拼接过程中发现,此类的拼接此类的拼接无需无需蛋白质的酶蛋白质的酶参与作用参与作用,它可自我催化完成。它可自我催化完成。CechCech称称具有催化功能的具有催化功能的RNARNA为为核酶核酶(ribozyme)(ribozyme)。19891989年年cech Tcech T和和Altman SAltman S共同获诺贝尔化学奖共同获诺贝尔化学奖,Altman S,Altman S的贡献是发的贡献是发现现Rnase
33、 PRnase P中的中的M1RNAM1RNA单独也具有催化功能单独也具有催化功能 。核酶的发核酶的发现现改变了酶的化学本质是蛋白质的传统观念改变了酶的化学本质是蛋白质的传统观念,被认为是被认为是近二十年来生物化学领域中近二十年来生物化学领域中最令人鼓舞的成就之一。最令人鼓舞的成就之一。The M1 RNAin ribonucleaseP is catalyticThe intron inthe pre-rRNA ofTetrahemena is self-spliced 因发现核酶而获诺贝因发现核酶而获诺贝尔奖的两位科学家尔奖的两位科学家:一、蛋白质合成简介一、蛋白质合成简介:蛋白质合成的信
34、蛋白质合成的信息来自于息来自于DNA,DNA,合成的模板是合成的模板是mRNAmRNA蛋白质的合成机制是最复杂的生物合成机制蛋白质的合成机制是最复杂的生物合成机制蛋白质的合成机制是最复杂的生物合成机制蛋白质的合成机制是最复杂的生物合成机制:真核细胞中真核细胞中,蛋白质的合成需要蛋白质的合成需要:7070种以上种以上的核糖体蛋白参与的核糖体蛋白参与;多于二十种多于二十种的酶来激活氨基酸的酶来激活氨基酸;1212种或更多种或更多的辅酶和其它专一性的蛋白因子来的辅酶和其它专一性的蛋白因子来进行肽链合成的起始、延伸、和终止进行肽链合成的起始、延伸、和终止;一百多种一百多种酶参与各类蛋白的最后修饰酶参与
35、各类蛋白的最后修饰;还需要多于还需要多于四十种四十种的的tRNAtRNA和核糖体和核糖体RNARNA。共有共有300300多种多种不同的生物大分子参与且协同地不同的生物大分子参与且协同地工作来合成多肽。工作来合成多肽。蛋白质生物合成研究中的重要进展蛋白质生物合成研究中的重要进展:1 1、蛋白质合成场所的确定、蛋白质合成场所的确定:2020世纪五十年代世纪五十年代,Paul Zamecni,Paul Zamecnik 等给小白等给小白鼠注射鼠注射带放射性标记的氨基酸带放射性标记的氨基酸,然后在不同时然后在不同时间取小白鼠的肝脏间取小白鼠的肝脏,经匀浆、离心、检测发现经匀浆、离心、检测发现注射的氨
36、基酸几分钟后出现在注射的氨基酸几分钟后出现在核糖核蛋白体颗核糖核蛋白体颗粒粒上上,几小时或几天后所有的几小时或几天后所有的亚细胞成分亚细胞成分都含都含有放射性标记。这证明蛋白质的合成是在有放射性标记。这证明蛋白质的合成是在核糖核糖体体上进行的。上进行的。2 2 2 2、mRNA(mRNA(mRNA(mRNA(信使信使信使信使RNA)RNA)RNA)RNA)概念的提出概念的提出概念的提出概念的提出:蛋白质的合成是在核糖体上进行的蛋白质的合成是在核糖体上进行的,而遗传信息载体而遗传信息载体DNA DNA 存在于核中存在于核中,必然有一种中间物来传递必然有一种中间物来传递DNADNA上的信息。上的信
37、息。3 3 3 3、遗传密码的破译、遗传密码的破译、遗传密码的破译、遗传密码的破译:19541954年年,物理学家物理学家GamouvGamouv G G首先对首先对遗传密码遗传密码进行探进行探讨。他认为核酸分子中只有四种碱基讨。他认为核酸分子中只有四种碱基,显然碱基与氨显然碱基与氨基酸的关系不是一对一的关系。若两个碱基决定一个基酸的关系不是一对一的关系。若两个碱基决定一个氨基酸只能编码氨基酸只能编码1616种氨基酸种氨基酸,也是不够的也是不够的;而三个碱基而三个碱基对一个氨基酸对一个氨基酸,四个碱基可产生四个碱基可产生6464个密码个密码,足以编码足以编码2020种氨基酸种氨基酸,所以编码氨
38、基酸的所以编码氨基酸的最低碱基数是最低碱基数是3 3,即密码即密码子可能是子可能是三联体三联体。19611961年年,CrickCrick F H C F H C等人用等人用遗传学的方法遗传学的方法证明了证明了三联密码子的学说是正确的。三联密码子的学说是正确的。19611961年年,NirenbergNirenberg 等人用等人用大肠杆菌的无细胞体系大肠杆菌的无细胞体系在在各种各种RNARNA的人工模板下合成的人工模板下合成多肽多肽,从而推断出从而推断出各氨基酸各氨基酸的密码子。的密码子。三种三种RNARNA在蛋白质合成中的作用在蛋白质合成中的作用 rRNArRNA 与蛋白质构成核糖核蛋白体
39、与蛋白质构成核糖核蛋白体,是是蛋白质合成的场所蛋白质合成的场所,核糖体由大亚基和小核糖体由大亚基和小亚基构成亚基构成 mRNA mRNA 是蛋白质合成的直接模板是蛋白质合成的直接模板 tRNAtRNA 是专一运送氨基酸至是专一运送氨基酸至mRNAmRNA并于并于密码子配对密码子配对mRNAmRNAmRNAmRNA是蛋白质合成的直接模板是蛋白质合成的直接模板是蛋白质合成的直接模板是蛋白质合成的直接模板 tRNAtRNA是将是将mRNAmRNA的核苷酸顺序转换成蛋白质的核苷酸顺序转换成蛋白质多肽链顺序的适配器多肽链顺序的适配器:tRNAtRNA分子上三个特定的碱基组成一个分子上三个特定的碱基组成一
40、个反密码子反密码子,位位于反密码子环上于反密码子环上,这是这是tRNAtRNA与与mRNAmRNA的识别部位。的识别部位。在蛋白质合成中在蛋白质合成中,tRNA,tRNA起着起着运载氨基酸运载氨基酸的作用的作用,按照按照mRNAmRNA链上的密码子所决定的氨基酸顺序将氨链上的密码子所决定的氨基酸顺序将氨基酸转运到核糖体的特定部位。基酸转运到核糖体的特定部位。同义同义tRNAtRNA:一种氨基酸可以有一种以上一种氨基酸可以有一种以上tRNAtRNA作为作为运载工具。通常把携带相同氨基酸而反密码子不同运载工具。通常把携带相同氨基酸而反密码子不同的一组的一组tRNAtRNA称为同义称为同义tRNAt
41、RNA.tRNA的结构与功能 tRNAtRNA凭借自身的反密码子与凭借自身的反密码子与mRNAmRNA链链上的密码子上的密码子相识别相识别,把所带氨基酸放到把所带氨基酸放到肽链的一定位置肽链的一定位置。tRNAtRNA的的“接头作用接头作用”tRNAtRNA与与mRNAmRNA的的结合部位结合部位:反密码子反密码子35ICCA-OH53CCA-OHG G CC C G 密码子与反密码子的密码子与反密码子的阅读方向均为阅读方向均为55 3 3，两者两者反向平行反向平行配对。配对。rRNArRNArRNArRNA构成的核糖体的结构与功能构成的核糖体的结构与功能构成的核糖体的结构与功能构成的核糖体的
42、结构与功能 核糖体是由几十种蛋白质和几种核糖体是由几十种蛋白质和几种rRNArRNA组成的亚细组成的亚细胞颗粒胞颗粒,其中蛋白质与其中蛋白质与rRNArRNA的重量比约为的重量比约为1:21:2。核糖。核糖体是蛋白质合成的场所。体是蛋白质合成的场所。rRNA与蛋白质构成的核糖体rRNA与蛋白质构成的核糖体 核糖体的核糖体的存在形态存在形态有三种有三种:单核糖体、核糖单核糖体、核糖体亚基和多核糖体。体亚基和多核糖体。真核生物真核生物:游离核糖体或与内质网结合游离核糖体或与内质网结合 原核生物原核生物:游离核糖体或与游离核糖体或与mRNAmRNA结合成串状结合成串状的多核糖体的多核糖体(提高翻译效
43、率提高翻译效率)。核糖体的存在形式核糖体的存在形式:多核糖体多核糖体 大肠杆菌由一定数目大肠杆菌由一定数目的单个核糖体与一个的单个核糖体与一个mRNA mRNA 分子结合而成的分子结合而成的念珠状结构。每个核糖念珠状结构。每个核糖体可独立完成一条肽链体可独立完成一条肽链的合成的合成,所以在多核糖所以在多核糖体上可以同时进行多条体上可以同时进行多条肽链的合成肽链的合成,提高了翻提高了翻译的效率。译的效率。多核糖体核糖体上的功能部位核糖体上的功能部位 大肠杆菌中大肠杆菌中30S30S的亚基能单独与的亚基能单独与mRNAmRNA结结合成合成30S30S核糖体核糖体-mRNA-mRNA复合体复合体,后
44、者与后者与tRNAtRNA可以专一性结合。可以专一性结合。50S50S亚基不能单独与亚基不能单独与 mRNAmRNA结合结合,但可以非专一地与但可以非专一地与tRNAtRNA结合结合,50S50S亚基上有两个亚基上有两个tRNAtRNA结合位点结合位点:氨酰基位氨酰基位点点-A;-A;肽酰基位点肽酰基位点-P-P。还有一个。还有一个GTPGTP结合位结合位点。点。P P位和位和A A位位,二者二者紧密连接紧密连接,各占一个密码子的距离。各占一个密码子的距离。P:P:结合起始的氨酰结合起始的氨酰-tRNAtRNA和肽酰和肽酰-tRNA,tRNA,A:A:结合新掺入的氨酰结合新掺入的氨酰-tRNA
45、tRNA。核糖体的核糖体的A A部位与部位与P P部位部位:A53P二、遗传密码及其破译方法二、遗传密码及其破译方法 遗传密码的概念遗传密码的概念:mRNA mRNA 上的核苷酸顺序与蛋白质中上的核苷酸顺序与蛋白质中的氨基酸之间的对应关系称为遗传密码。的氨基酸之间的对应关系称为遗传密码。mRNAmRNA上每三上每三个连续核苷酸对应一个氨基酸个连续核苷酸对应一个氨基酸,这三个核苷酸就称为这三个核苷酸就称为一个密码子一个密码子,或三联体密码或三联体密码(triplet codons)(triplet codons)。三个不同的实验证明了遗传密码是三个不同的实验证明了遗传密码是mRNAmRNA上上3
46、 3个连个连续的核苷酸残基构成的。续的核苷酸残基构成的。NirenbergNirenberg、KhoranaKhorana因因遗传密码的破译遗传密码的破译而与另一而与另一位科学家位科学家(霍利霍利)分享了分享了19681968年诺贝尔生理学奖。年诺贝尔生理学奖。第一个实验第一个实验是是19611961年由美国的年由美国的M.NirenbergM.Nirenberg等人完成等人完成的。他首先利用多核苷酸磷酸化酶合成了一条由相同核的。他首先利用多核苷酸磷酸化酶合成了一条由相同核苷酸组成的多核苷酸链苷酸组成的多核苷酸链,用它作模板用它作模板,利用大肠杆菌蛋白利用大肠杆菌蛋白提取液和提取液和GTPGT
47、P在体外合成蛋白质。发现多聚在体外合成蛋白质。发现多聚(U)(U)导致多聚导致多聚PhePhe的合成的合成,表明多聚表明多聚(U)(U)编码多聚编码多聚Phe;Phe;类似的实验表明类似的实验表明,多聚多聚(A)(A)编码多聚编码多聚Lys;Lys;多聚多聚(C)(C)编码多聚编码多聚ProPro(下图下图A)A)。(一一一一)证明三联体密码的三个实验简介证明三联体密码的三个实验简介证明三联体密码的三个实验简介证明三联体密码的三个实验简介 第二个实验第二个实验是是19641964年也是由美国的年也是由美国的M.NirenbergM.Nirenberg等人等人完成的。他们首先合成一个已知序列的核
48、苷酸三聚体完成的。他们首先合成一个已知序列的核苷酸三聚体,然然后与大肠杆菌核糖体和氨酰后与大肠杆菌核糖体和氨酰tRNAtRNA一起温育。由此确定与一起温育。由此确定与已知核苷酸三聚体结合的已知核苷酸三聚体结合的tRNAtRNA上连接的是那一种氨基酸。上连接的是那一种氨基酸。该实验对于几种密码编码同一个氨基酸提供了直接的、该实验对于几种密码编码同一个氨基酸提供了直接的、最好的证据最好的证据(下图下图B)B)。第三个实验第三个实验是由是由Jones,KhoranaJones,Khorana等人完成的。他等人完成的。他们们利用有机化学和酶法利用有机化学和酶法制备了已知的核苷酸重复序制备了已知的核苷酸
49、重复序列列,以此多聚核苷酸作模板以此多聚核苷酸作模板,在在体外体外进行蛋白质合成进行蛋白质合成,发现可以生成三种重复的多肽链发现可以生成三种重复的多肽链(下图下图C)C)。若从若从A A翻翻译译,则合成出多聚则合成出多聚Ile,Ile,即即AUCAUC对应对应Ile;Ile;若从若从U U翻译翻译,则则合成出多聚合成出多聚Ser,Ser,即即UCAUCA对应对应Ser;Ser;若从若从C C翻译翻译,则合成出则合成出多聚多聚His,His,即即CAUCAU对应对应HisHis。这是因为体外合成是无调。这是因为体外合成是无调控的合成控的合成,可以随机地从可以随机地从A A、或、或U U、或、或C
50、 C翻译翻译,所以有三所以有三种重复的多肽链生成。种重复的多肽链生成。证明三联体密码的三个著名实验的示意图证明三联体密码的三个著名实验的示意图证明三联体密码的三个著名实验的示意图证明三联体密码的三个著名实验的示意图遗传密码表遗传密码表遗传密码表遗传密码表(阅读方向为阅读方向为阅读方向为阅读方向为53535353)密码的简并性密码的变偶性(1)密码的变偶性(2)密码的几乎通用性与变异性AUG是蛋白质合成的起始密码,UAA、UAG、UGA是蛋白质合成的终止密码三、蛋白质合成的五个阶段三、蛋白质合成的五个阶段三、蛋白质合成的五个阶段三、蛋白质合成的五个阶段(大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌)tRNA