《Cas作用机制及最新研究成果,生物化学论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Cas作用机制及最新研究成果,生物化学论文.docx（5页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、CRISPR/Cas作用机制及最新研究成果,生物化学论文基因组编辑是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列进而发生遗传改变的技术，主要是进行 DNA 序列的敲除、插入、定点突变和组合编辑等，进而实现基因功能与调控元件的系统研究1.基因组编辑技术日益成为生物学研究的热门，当前基因组编辑技术主要包括巨核酶技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应因子核酸酶技术及CRISPR 相关核酸酶技术2.它们在基因工程中已经得到了众多成功的应用，然而上述传统的基因组编辑技术存在明显的缺乏。例如，锌指核酸梅zinc-fingernucleases,ZFN和转录激活因子样效应因子核酸梅transcriptio
2、nactivator-likeeffectornucleases,TALEN核酸酶技术原理几乎是一样的，而一个新的 ZFN 和 TALEN 嵌合蛋白均需改造才能辨别靶序列，这就使得两种基因组编辑技术的广泛推广应用受阻，但 CRISPR 相关核酸酶技术只需要一小段引 导 RNAguideRNA、g RNA 就 能 识 别 特 定 的DNA2,且一个新的位点只需要一个新的 g RNA,极大的简化了基因组编辑的经过，扩大靶位点的选择，具有更大的潜力。CRISPR 系统可以以应用于靶向基因突变和基因修正，能够实现大片段 DNA 的缺失以及复合基因编辑。本文将针对 CRISPR/Cas 系统的构造、分类
3、、原理以及当前具有突破性研究并迅速发展的 Type CRISPR/Cas 系统和 Type CRISPR/Cas 系统的突破性研究做较为详尽的综述。1 CRISPR/Cas的基因座构造CRISPR/Cas 的基因座构造相对简单图 1，对于一个有效的 CRISPR/Cas 系统而言，通常包含两个部分 :第一部分是位于基因组中正向重复序列和来源于外源 DNA 的间隔序列组成 3 端 CRISPR 基因座，对于重复序列而言在长度和序列上几乎一致，在不同的物种之间长度范围在 21-47bp,平均在32bp3,4;间隔序列在长度上是一致的，长度范围在 20-72bp,但在序列上表现出多样性4,5.亲缘关
4、系相近的物种具有类似的重复序列，但是在全部的细菌和古细菌序列中间隔序列和重复序列都表现出极大的差异6.第二部分是位于 CRISPR 基因座 5 端成簇的 Cas 基因，主要包括一些核酸酶、解旋酶、聚合酶和 RNA 结合蛋白等，主要介入 CRISPR/Cas系统介导的免疫经过7.2 CRISPR的分布与分类当前对于 CRISPR/Cas 系统而言主要分为 3 种类型 :Type 、Type 、Type 三种不同类型8,从另一方面也反映出在自然界中 CRISPR/Cas 系统具有多态性。Type CRISPR/Cas 系统在细菌和古细菌中被发现，包含 6 种不同的 Cas 蛋白，华而不实在干预反响
5、中最重要和最显着的是 Cas3 蛋白，它包含一个 HD磷酸化水解酶构造域和一个类 DEx H 解旋酶构造域，这两个构造域在 ATP 和Mg2+存在的情况下能够解开ds DNA解旋酶构造域和切割 ss DNAHD 核酸构造域9.Type CRISPR/Cas 系 统 仅 仅 在 细 菌 的 基 因组中发现9,华而不实 Cas9 是分子量很大的多功能蛋白， 参 与 cr RNAs 的 成 熟 和 随 后 的 干 涉 反 应10.Cas9 蛋白包含有两个亚基，在 Mg2+存在条件下，华而不实 Mcr A/HNH 切割与 cr RNA 互补的 DNA 链，而类Ruv C 切割非互补链9.Type CR
6、ISPR/Cas 系统主要在古细菌中发现，包括 typeIII-A 和 typeIII-B 两种类型，两者的差异不同主要是A型干扰的靶标是 m RNA,B 型干扰的靶标是 DNA11, 其 中 typeIII-B 系 统 与 其 他 1 或 2 种CRISPR 亚单位相结合9.typeIII-B 系统特征性蛋白是 Cas10 蛋白，而Cas10 蛋白具有 RNA 活性介入 cr RNA 的成熟和剪切入侵外源 DNA9,10.近期几年，CRISPR/Cas 技术因其相对较为简单，而得到较为迅速的发展，如在作物育种、基因治疗以及动物建模等领域都已得到广泛的应用12.随着测序技术的不断发展，越来越多
7、的细菌和古细菌的基因组信息被解密，为后续 CRISPR/Cas 系统的改造和应用提供愈加有力的指导。3 CRISPR/Cas作用机制3.1 Type CRISPR/Cas系统基本原理一个简易的 Type CRISPR/Cas 系统必定要含有 Cas9 和 g RNA,Cas9 核酸酶具有改造 cr RNA 和毁坏双链 DNA 的双重功能13,位于 g RNA5 端的 20个左右的碱基决定 CRISPR/Cas9 系统在应用时 Cas9核酸酶特异性切割的部位，主要负责决定 CRISPR/Cas9 系统的特异性。基 本 原 理 图 2：首 先，Cas9 蛋 白 与 g RNA构成复合体 ;其次，上
8、述复合体切割与 g RNA 的spacer 互补的基因组 DNA 序列 ;随后造成双链 DNA的损伤 ;最后通过体内的 NHEJ 或 HR 修复机制将引入基因突变14.3.2 TypeCRISPR/Cas系统基本原理Type CRISPR/Cas 系统包含的两种类型中以A 型研究较为突出，这里以 typeIII-A为例。A型干扰的 m RNA 首先转录构成 DNA,Cas10-Csm 核糖核蛋白体，在 cr RNA 的引导下对与 cr RNA 互补的DNA 双链或单链进行切割16,进而造成 DNA 的损伤图 3。4 CRISPR/Cas系统之间的比拟Type CRISPR/Cas 系统在近期几年研究炽热，其突出的优点在于构造简单，系统容易设计，仅需要较短的 g RNA 和 Cas9 核酸酶就能够完成对特定靶基因的人工编辑，但是该系统存在较严重的脱靶把效应，使其广泛应用遭到限制。Type CRISPR/Cas 系统与其他两种类型相比存在自个独有的亮点 :1Type CRISPR/Cas 系统只要在靶 DNA 转录的情况下才发挥功能。2Cas10-Csm 复合物不仅具有执行引导 RNA 切割 DNA的能力，也具有切割 RNA 的能力。这些突出的优点揭示了一种全能型的 CRISPR 免疫系统16.