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1、神经生长因子对蒙古马排卵的影响研究,兽医硕士论文在繁育季，从业人员对母马进行系统的繁育健康检查BSE，尤其是评估母马的发情鉴定和排卵机会对于提高受精率尤为重要。马的排卵经过受内分泌系统和神经系统共同调节。近年来，利用促排激素及合成类似物预测排卵的临床应用较为广泛，但我们国家地方马品种的具体超声应用、繁育健康检查、促排激素水平测定情况及排卵前优势卵泡直径阈值等相关数据信息严重缺乏。研究发现，作为神经营养因子家族的 神经生长因子Nerve growth factor-Beta，NGF- 不仅作用于神经系统，而且对生殖系统也有重要调节作用。NGF- 在水牛、鸡和绵羊等不同动物的颗粒细胞和卵细胞上均有
2、表示出，且在羊驼和骆驼精浆中作为主要诱排剂，但其在马繁育方面的应用仍很少。因而，从NGF- 角度初步讨论其促进蒙古马排卵的相关应用研究，具有一定的科学意义。 体内实验首先对94匹蒙古母马进行BSE，统计发现56匹母马排卵前48-72 h优势卵泡直径平均值为35.8 mm。其次，挑选出BSE正常的42匹年轻母马和2匹h CG耐受的母马，当优势卵泡到达35 mm，最后进行NGF- 促排应用+。华而不实NGF- 剂量及给药途径包括肌肉注射，静脉注射和子宫内灌注的挑选试验为NGF- 注射促排应用试验提供最佳给药方案。在NGF- 注射促排应用试验中通过比拟12匹母马n=3在四个发情期里肌肉注射0.5mg
3、 NGF- 、马精浆粗液、1.0 mg地洛瑞林和等量生理盐水后促排情况，另外2匹h CG耐受母马给予肌肉注射2000 IU h CG、0.5 mg NGF- 、1.0 mg地洛瑞林和等量生理盐水探究母马促排情况。母马促排应用的结果主要根据直肠超声检查监测卵泡排卵情况进行断定。 蒙古马血清中卵泡刺激素FSH、黄体生成激素LH及NGF- 含量的测定试验、马精浆蛋白SDS-PAGE试验、马输卵管NGF- 及其受体Trk A免疫组化试验和NGF- 促进蒙古马卵母细胞体外成熟的体外试验，以体外培养原代蒙古马卵丘-卵母细胞复合体COC为切入点，添加50 ng/m L NGF- 处理后评估卵母细胞体外成熟培
4、养情况。体外实验讨论蒙古马的内分泌激素规律以及正常排卵指标，研究NGF- 能否存在于蒙古马输卵管和精浆中，以及能否促进蒙古马卵细胞成熟。 NGF- 剂量及给药途径的挑选试验结果显示1.0 mg和0.5 mg剂量给药组中除子宫内灌注组外，其余实验组促排率达100%P 0.01。最适NGF- 剂量为0.5 mg，给药途径为肌肉注射，为NGF- 注射促排应用试验最佳给药方案。结果表示清楚：蒙古母马优势卵泡到达35 mm后，经肌肉和静脉途径注射等剂量NGF- 促排效果无明显差异，均促排良好。0.5 mg NGF- 与常规Gn RH冲动剂类似物地洛瑞林相比促排效果相近。NGF- 具有作为母马促排剂的潜力
5、且对耐受h CG母马促排有效，但蒙古马精浆粗液及子宫输注NGF- 促排效果差。研究发现蒙古马精浆中存在NGF- 。NGF- 及其受体Trk A在发情期和间情期的蒙古马输卵管上均有表示出，且发情期表示出量高于间情期。由于仅一个马卵母细胞培养成熟，该部分没有能作为结论。 本研究阐述和实操的母马繁育健康检查BSE对从业人员进行马繁育临床实操具有重要的意义。描绘叙述蒙古马的内分泌激素以及正常排卵指标，对马的基础繁育生物学的知识有所奉献。探究活性NGF- 能否有潜力成为马促排卵剂，为后续开发兽药、诊疗，尤其对h CG耐受母马的诊疗应用以及后续马繁育研究开展提供一定程度的参考价值。 本文关键词语： 神经生
6、长因子，母马促排，繁育健康检查，排卵预测，繁育直肠超声应用。 Abstract The Application of Nerve Growth Factor-Beta in Promoting Ovulation of Mongolian Mares The importance of breeding soundness examination (BSE), especially evaluates the estrus and ovulation timing of mares for breeders in breeding seasons can never be underestim
7、ated, particularly when it comes to increasing fertilization rates. Ovulation process is regulated by endocrine system and nervous system. The effects of hormones in endocrine system on mare s ovulation have been fully studied, so was the clinical application of hormones on accurately predicting ovu
8、lation. However, specific to the local equine breeds in China, the detailed ultrasonic application of BSE of hormone levels and the pre-ovulation follicle diameter threshold were rarely systematically described. Nerve growth factor-Beta (NGF- ) is a part of the neurotrophic factor family. In recent
9、studies, NGF- has been found to act not only on nervous system, but also on reproductive system. It was expressed on granulosa cell and oocyte in different animals, such as buffaloes, chicken, and sheep. NGF- is a major component of alpaca seminal plasma and induces ovulation in female alpacas and c
10、amelids, but there is still very little research on equine; Therefore, based on previous research, the research was significantly conducted to pilot explore the application of NGF- in promoting ovulation of mares. In vivo experiments were carried out on Mongolian mares by using BSE and NGF- promotin
11、g ovulation application (+). Breeding soundness examination (BSE) of 94 Mongolian mares was conducted, and the average 35.8 mm value of 56 mares of the dominant follicles, 48 to 72 hours before ovulation was calculated. Forty-two young mares with normal BSE results and 2 h CG-tolerant mares were sel
12、ected as the main subjects of NGF- promoting ovulation application (+) . In the pilot study(),when the mare dominant follicles reached 35 mm, Pre-examination of different administration routes (intramuscular injection, intravenous injection, and intrauterine infusion) and dosage of NGF- was performe
13、d in groups and provided the best dosing regimen for the NGF- injection application experiment (). In the experiment of NGF- injection application (), when 12 follicles (n=3/group) of the mare reached35 mm, they were intramuscularly administered with stallion crude seminal plasma,0.5 mg NGF- , 1.0 m
14、g deslorelin and equivalent amount of 0.9% saline to promote ovulation during four estrus cycle. To study their ovulation, the other two h CG-tolerant mares were injected with 2000 IU h CG, 0.5 mg NGF- , 1.0 mg deslorelin and equivalent amount of 0.9% saline. The results were judged by rectal ultras
15、ound monitoring of follicular ovulation. In vitro experiments were the determination of the follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and NGF- in Mongolian mare s serum, the SDS-PAGE test of stallion crude seminal plasma protein, NGF- of mare fallopian tube Trk A immunohistochemis
16、try test and NGF- promoted Mongolian horse oocyte maturation test in vitro which using the primary Mongolian horse cumulus-oocyte complex (COC) cultured in vitro, after adding 50 ng/m L NGF- assess the maturation of oocytes. In vitro experiments explored the endocrine hormone law and normal ovulatio
17、n index of Mongolian mares, whether NGF- was present in the oviduct and seminal plasma of horses, and whether it promoted the maturation of Mongolian oocytes. The screening experiment of NGF- doses and administration route () that in the 1.0 mg and 0.5 mg doses administration groups, except the intr
18、auterine infusion group, the rest of the experimental group had 100% ovulation rate (P 0.01). The optimum dosage regimen of Ovulation Induction Experiment with NGF- Injection (II) should be intramuscular injection with 0.5 mg NGF- . It turns out that when the dominant follicle of a Mongolian mare re
19、ached 35mm, ovulation induction was effective by whether intramuscular or intravenous injection with the same dosage of NGF- ,which is not significantly different. NGF- (0.5 mg) had a similar ovulation promoting effect to general analogues of Gn RH agonist (e.g. deslorelin). NGF- , with ovulation in
20、duction potential, is effective in promoting the ovulation of h CG-tolerant mares. Stallion crude seminal plasma and intrauterine infusion had poor effect. The study discovered that NGF- exists in seminal plasma of Mongolian horses. NGF- and its receptor Trk A were expressed on oviducts of mares dur
21、ing estrus and diestrus,and the expression during oestrus was higher than that during dioestrus. Since only one equine oocyte matured in culture, this part could not be concluded. Breeding soundness examination(BSE) is significant to clinical application of practitioner. Describe basic clinical and
22、endocrine parameters and normal ovulation of Mongolian horses, which can be a contribution to the general knowledge of equine reproductive biology. The research explored whether NGF- can be an ovulation induction agent, and serve as important references to the development of veterinary drugs, diagno
23、sis and treatment, especially for the treatment of h CG-tolerant mares and will contribute to follow-up horse breeding research. Keywords: Nerve growth factor-Beta, ovulation induction in mares, breeding soundness examination, ovulation prediction, breeding rectal ultrasound application。 引 言 马产业里，繁育
24、是支撑整个产业链的基础。以纯血马赛马产业链为例子，其有四大环节，分别是最基本的育马场繁育育种Breeding、拍卖会等交易Auction Sales 、 练 马 师 马 匹 赛 事 调 训 Pre-trainning 以 及 赛 事Racing。繁育是循环链中最基础的环节，尤其在英国起源的赛事规则Stud book中，规定纯血马只允许自然交配Live cover，不可人工授精Artificial insemination, AI。这决定了贵重种马资源的繁育质量等需得到高度保障，以确保母马平安且马驹顺利出生。马是自发性排卵动物，无论能否有公马的交配刺激，母马在发情期都会自发排卵，由于公马不能精到
25、准确地预测排卵的时间，因而自然交配妊娠率低。母马有特殊的生殖解剖构造例如排卵窝fossa，再加上排卵预测较难，双胞胎妊娠对母马而言非常危险，常规母马促排不能朝着超数排卵方向发展。多数母马的优势卵泡在发情期结束前24-48小时内排卵，最佳的交配时间为排卵前后12小时左右1。综上原因，在母马繁育中为提高受精率，预测马排卵及促进卵泡发育，尤其促进优势卵泡排卵在马繁育研究中极具意义。我们国家不乏地方良马马种，华而不实蒙古马既作为世界名马之一又作为我们国家北方地区特有的马遗传资源，国内一直有做马育种保种工作，但在系统的繁育健康检查和研究上仍落后。以雌激素为主的作用下，从业者主要根据母马发情期卵泡软硬程度
26、及生殖道变化，常采取触诊手段预测马匹排卵，老前辈们的经历体验总结借鉴异常贵重，但对于应对规模产业化而言就显得普及性缺乏。马繁育预测排卵中对卵泡大小最直观的评估是通过直肠超声扫描检查监测卵泡生长情况。西方国家关于超声技术预测马排卵的应用可追溯到20世纪80年代1，有关促排激素调节马内分泌系统的研究亦特别透彻。华而不实，持续使用人绒毛膜促性腺激素h CG促排因母马产生抗体而存在效果降低的情况。固然Gn RH冲动剂类似物地洛瑞林Deslorelin，布舍瑞林Buserelin和组氨瑞林Histrelin等在马繁育临床应用普遍，但在中国市场未见有商品化Gn RH冲动剂类似物的投入，部分地区仍在使用易使
27、母马产生耐受的h CG进行促排。 再有，在牧区地区难以保障药物存储及运输。国外母马繁育生理学指标，预测排卵经历体验虽能够参考借鉴，但蒙古马详细国产蒙古马全面的促排激素水平值还尚不明确，所在纬度和繁育季时间、生活环境和国外品种马不一样，环境温度总体而言较低，可能导致出现发情期更长，个体差异排卵规律更难探索，卵泡直径更大等现象。因而探究新的微量高效且低成本的促排卵成分及方式方法将对没有超声设备的普通牧民及基层从业人员马繁育临床应用具有重要的意义。 NGF- 在基础研究层面，已有很多有关繁育作用研究。NGF- 广泛表示出于各类动物卵巢细胞、卵巢颗粒细胞中。本文临床应用以NGF- 促进羊驼排卵临床试验
28、文献应用为参照2,3。实验室部分，牵涉促排激素FSH、LH水平检测，NGF- 在生殖系统中大致定位定量实验，包括免疫组化和ELISA试验。系统阐述兽医在马发情期怎样对母马进行系统的繁育健康检查(BSE)，能够更好地预测马排卵。本实验临床部分牵涉BSE临床操作，对56匹蒙古母马优势卵泡排卵前阈值进行统计，并挑选出最适正常年轻母马作为蒙古马NGF- 促排应用+实验对象。 NGF- 剂量及给药途径的挑选试验选出最佳给药途径及NGF- 剂量，NGF- 注射促排应用试验以肌肉注射Gn RH冲动剂类似物地洛瑞林为阳性对照，以0.9%生理盐水为阴性对照，以及母马本身前后发情期排卵情况比对，以母马直肠触诊及超
29、声检查进行排卵确认并分析NGF- 及蒙古马精浆对母马促排临床应用的作用。 文献综述。 1、母马的繁育健康检查概述。 母 马 的 繁 育 健 康 检 查 BSE 又 称 为 繁 育 评 估 检 查 Reproductiveevaluation，要求从业人员熟识母马解剖学构造、马繁育生理学等。繁育健康检查包括母马的理化检查、马的外生殖器区域外观评估、马阴道及子宫检查、发情鉴定与排卵预测、记录马繁育史、繁育管理等，目的是对母马生殖潜力做出评估，找出与生育率下降相关的异常状况，提供治疗或管理方案。对个体母马系统的繁育健康检查以确保母马生殖健康，为后续受精做准备。 一份完好的繁育史需要记录：发情史，母马
30、当前生产状态初胎，当季未孕，怀孕或已产驹，上一繁育季BSE检查的情况，往日配种产驹基本信息，曾使用繁育技术及繁衍辅助技术人工授精，本交或群配以及所有发情周期呈现的异常情况，繁衍系统传染病史，子宫感染，胚胎死亡或流产史等4。 1.1、马卵巢和子宫解剖学构造。 卵巢是母马生殖系统的主要器官，负责卵细胞发育和内分泌调节，通过激素调控发挥作用。马有两个卵巢左右各一个，通常呈现类肾形状，但卵巢的详细形状和大小取决于优势卵泡发育程度以及排卵状态。卵巢在繁衍季节最大春季和夏季，在非繁衍季节最小冬季乏情期。卵巢的平均大小为长6至8 cm，宽3到4 cm，平均重量是70到80 g。卵巢位于毗邻的每个子宫角的末端
31、，位于腰部下面区域位于文章为硕士论文，如需全文请点击底部下载全文链接】 1.2、马的发情周期及激素调节 1.3、马的理化检查 1.4、马的外生殖器区域外观评估 1.5、马阴道及子宫检查 1.6 、马的发情鉴定. 1.7、马的排卵预测. 2 、 神经生长因子 2.1、 NGF- 简述 2.2、NGF- 在排卵中的作用. 实验内容 第一章 NGF- 促进蒙古马排卵的体内实验. 1、材料 1.1、实验动物. 1.2、主要药物及配制讲明 1.3、仪器设备 2、实验方式方法 2.1、NGF- 促进蒙古马排卵的体内实验的流程图及概述 2.2、母马初步马繁育健康检查(BSE) 2.3、蒙古马NGF _ 促排
32、应用( I+II ) 3、结果 3.1、母马外生殖器区域外观评估 3.2、马发情鉴定及排卵预测 3.3、 异常母马统计 3.4、 NGF- 剂量及给药途径的挑选试验( I ) 3.5、 NGF- 注射促排应用试验(II) 4、讨论. 5、小结 第二章 NGF- 促进蒙古马排卵的体外实验. 1、材料 1.1、试验材料. 1.2、实验试剂配制 2、实验方式方法. 2.1、蒙古马血清中FSH、LH及NGF 含量的测定试验. 2.2、马输卵管NGF . 免疫组化试. 2.3、NGF- 伲进蒙古马卵母细胞体外成熟试验. 2.4、蒙古马精浆蛋白SDS-PAGE试验. 3、结果 3.1、 蒙古马血清中FSH
33、、LH及NGF- 含量的测定 3.2、马输卵管NGF - 免疫组化试验. 3.3、蒙古马卵母细胞体外成熟试验. 3.4、蒙古马精浆蛋白SDS-PAGE 4、讨论. 5、小结. 结 论 1. 蒙古马优势卵泡排卵前48-72 h的阈值35.8 mm与体型相近的夸特马品种类似。 2. 蒙古马优势卵泡到达35 mm后，经肌肉和静脉途径注射等剂量NGF- 促排效果无明显差异，均促排良好，但子宫灌注给药途径的促排效果差。 3. 0.5 mg NGF- 与常规剂量的Gn RH冲动剂类似物地洛瑞林相比促排效果相近，其具有作为母马促排剂的潜力且对耐受h CG母马促排有效。马精浆粗液虽具有一定促排效果，但促排率低，效果不好像等条件下注射纯化NGF- 及地洛瑞林的促排效果。 4. 研究发现蒙古马精浆中存在NGF- 。NGF- 及其受体Trk A在发情期和间情期的蒙古马输卵管上均有表示出，且发情期表示出量高于间情期。 以下为参考文献