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1、诊断牛环形泰勒虫病的PCR方法建立,基因工程论文环形泰勒虫病又称热带泰勒病，是由泰勒虫属的环形泰勒虫感染牛引起的一类蜱传性血液原虫病蒋金书，。本病流行区域广泛，在北美、东欧、北非和亚洲地区均有分布，；等，是牛最严重的寄生虫病之一。环形泰勒虫病在中国广泛分布，新疆、甘肃、宁夏、内蒙古等个省区均有报道吕文祥等，；等，。临床异常感觉和状态主要为食欲不振、发热、浅表淋逢迎肿大、心跳过快、呼吸困难、贫血等汪明，；急性病例可见白细胞、淋巴细胞减少等典型血液学变化；慢性病例可致乳牛产奶量下降。近年来，环形泰勒虫的发病呈上升趋势，为养牛业的发展带来重大危害。有效的诊断对于减少该病引起的损失至关重要，而传统的血
2、涂片镜检法固然操作简单、用时较短，但当血液中的虫体数量下降到一定程度时，该法诊断容易漏检，故其准确性远达不到诊断和检测的要求志胜等，。因此选择一种适宜的诊断方式方法显得尤为重要。分子生物学诊断方式方法是近年来迅速发展起来的一种诊断方式方法，在寄生虫病诊断和研究中应用越来越广泛，且分子生物学诊断方式方法有替代传统诊断方式方法的趋势，因而利用分子生物学工具对环形泰勒虫进行检测和流行病学调查意义重大。聚合酶链式反响 ，作为一种普遍的分子生物学工具在各类寄生虫病的诊断中应用广泛。等初次将技术应用于泰勒虫病的诊断。等使用裂殖子主要外表抗原特异性引物，对采集的份牛血样进行了环形泰勒虫的检测，检出率为，与血
3、涂片镜检法的检出率和免疫荧光抗体检测的检出率相比，检测方式方法具有灵敏度高的优越性。故方式方法因其良好的特异性和较高的敏感性而广泛应用，不失为环形泰勒虫病诊断的一种好方式方法。在应用技术检测寄生虫感染时，良好的靶标序列的选择是非常重要的。环形泰勒虫裂殖体外表蛋白 ，是环形泰勒虫虫体发育阶段分泌出的一种膜内蛋白，其不但具有良好的免疫原性，作为一种关键的分子标记基因，在分子诊断方面同样具有重要的应用价值等，。等研究发现，基因固然显示出种内和种间的多态性，但不同来源的蛋白有一个共同的保守区，这一特性表示清楚，基因是潜在的分子生物学诊断靶标序列。等研究结果表示清楚，基于基因建立的检测方式方法可用于环形
4、泰勒虫病的流行病学调查。因而本试验以基由于靶标序列，根据登录的牛环形泰勒虫基因序列保守区设计合成对引物，建立诊断牛环形泰勒虫病的方式方法。材料与方式方法虫种与菌株试验用环形泰勒虫、中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、尤 氏 泰 勒 虫 、吕 氏 泰 勒、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫均由中国农业科学院兰州兽医研究所虫种资源保藏课题组提供；大肠杆菌购自公司。主要试剂 聚合酶、凝胶回收试剂盒、提取试剂盒、质粒提取试剂盒、 载 体 均 购 自公 司； 购自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常规试剂为进口或国产分析纯。方式方法目的基因扩增、克隆及测序 根据上颁布的牛环形泰勒虫基因序列登录号：，应用 软件
5、设计合成对特异性引物，引物序列为： ；： 。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。取感染虫血 ，参考基因组提取试剂盒进行牛环形泰勒虫基因组的提取。提取的基因组置保存备用。反响体系 ： ， ， 聚合酶 ，基因组模板 ，上、下游引物 各 ，加灭菌水至终体积 为 。反 应 条 件 为： 预 变 性；变性，退火，延伸，个循环； 延伸。反响结束后取 产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测。对产物利用凝胶回收试剂盒进行胶回收，将回收产物与 载体连接，氨苄青霉素挑选阳性克隆，将鉴定为阳性的克隆质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。特异性试验 以环形泰勒虫基因组A为试验样本，以环形泰勒虫、中华泰勒虫、瑟
6、式泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫基因组为对照检验本试验方式方法的特异性。敏感性试验 对提取的环形泰勒虫基因组模板连续倍稀释，使浓度梯度为至，根据上述反响条件进行扩增。临床样品检测 采集甘肃环形泰勒虫病流行区血样份，采集前动物无明显临床异常感觉和状态。采血前耳尖末梢血涂片染色镜检，对采集的血液样本处理后用上述方式方法检测。结果与分析牛环形泰勒虫 基因的扩增及测序结果以提取的牛环形泰勒虫基因组为模板进行扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出的目的基因片段图，与预期结果一致。将该目的片段胶回收后克隆至 载体，转化后，鉴定为阳性的克隆质粒送上海生工生物工
7、程技术服务有限公司测序。经软件 分析，基因序列与设计引物时所选 片 段登录号：的类似性为图。 特异性试验 用本试验建立的方式方法对环形泰勒虫、中华泰勒虫、瑟式泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫分别进行检测，结果见图。由图可知，只要环形泰勒虫能扩增出预期的条带，表示清楚该方式方法特异性好。 灵 敏 度 试 验 对 环 形 泰 勒 虫 基 因 组模板 进 行 不 同 浓 度 梯 度 的 稀 释，当 稀 释 到时，仍然能检测到目的条带图临床样本的检测 对甘肃省肃北县牛环形泰勒虫病流行地区采集的份血液样本进行扩增和血液涂片镜检，阳性率为，而血涂片染色镜检的阳性
8、率仅为。讨论环形泰勒虫病是严重危害牛的一种寄生虫病，近年来随着养牛业的发展和牛的频繁交易，环形泰勒虫的流行区域在逐步扩大，发病率也随之升高，给养牛业带来了宏大损失。当前中国对环形泰勒虫病的诊断主要还是依靠血涂片染色检查。固然血涂片染色镜检方式方法方便快速、应用较广，但当环形泰勒虫隐性感染和红细胞染虫率较低时，检测较为困难。同时由于血涂片制作及染色技术等原因，常规血涂片染色方式方法敏感率较低，常出现误诊。因此利用基因工程技术建立分子生物学诊断方式方法不失为一种好的选择。是在体外模拟自我复制的核酸扩增技术，与其他诊断方式方法相比，方式方法特异性强、敏感度高，当前已广泛应用于疾病的诊断。据报道，的灵
9、敏度为 血样中个梨形虫，因此建立环形泰勒虫诊断方式方法有很大的应用价值等，。据报道，环形泰勒虫诊断方式方法较好的靶标序列是核糖体罗金等，；，基因序列。大量研究结果表示清楚，一些保守的抗原基因在候选诊断抗原方面具有重要的潜在应用价值罗金等，；王轶男等，。因而，以潜在抗原蛋白为目的序列建立的一系列诊断方式方法得到了广泛的应用。基因是利用抗裂殖体免疫血清挑选环形泰勒虫表示出 文 库 得 到 的 一 种 单 拷 贝 基 因 等，在孢子体和裂殖体阶段表示出，具有较好的免疫原性，同时该蛋白基因是高度保守的，因此可作为诊断和预防环形泰勒虫病的理想抗原。本研究以环形泰勒虫基因序列保守区设计对特异性引物，建立了
10、环形泰勒虫病原体诊断方式方法。本试验将产物克隆测序后，显示该基因序列为环形泰勒虫高免疫原区片段。利用该片段作为检测序列，以中华泰勒虫、瑟式泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫的基因组作为对照，均没有特异性条带出现。同时将环形泰勒虫基因组模板倍比稀释，当稀释度到达时，仍然能检测到目的条带的出现，讲明本试验建立的检测方式方法具有特异性高、敏感性好的特点。利用本试验建立的方式方法和血涂片法对甘肃省肃北县牛环形泰勒虫病进行检测，对收集的份牛血样检测显示，诊断方式方法的阳性率为，高 于 血 涂 片 染 色 镜 检 的 阳 性 率，两者 符 合 率 为。表 明 本
11、试 验 建 立 的诊断方式方法具有一定的可靠性和准确性。本试验建立的诊断方式方法为环形泰勒虫病的快速诊断提供了条件，也对环形泰勒虫的鉴别诊断及分子流行病学调查具有重大应用意义。参 考 文 献王轶男，贾立军，薛书江，等牛瑟氏泰勒虫基因诊断方式方法的建立中国畜牧兽医，：吕文祥，吕文顺，张其才，等我们国家牛蜱传性血液原虫的虫种调查和分布特征的研究中国兽医科技，：汪明兽医寄生虫学第版北京：中 国农业大学出版社，罗金，刘光远，田占成，等基于基因序列的我们国家马梨形虫分类学地位分析动物分类学报，：罗金，刘光远，田占成，等，基于环形泰勒虫基因多态性的二温式检测方式方法的建立中国农业科学，：志胜，罗建勋，殷宏，等环形泰勒虫病诊断技术的发展大概情况青海畜牧兽医杂志，：蒋金书动物原虫病学北京：中国农业大学出版社， ，： ， ， ， ，： ， ， ， ， ： ： ，： ， ， ， ，： ， ， ， ， ，： ， ，： ， ： ， ， ， ， ， ，： ， ， ， ： ，： ， ， ， ： ，：.