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1、蓝色花卉基因工程育种实践与策略,基因工程论文摘 要： 蓝色花观赏价值高，花色成因复杂。当前，在蓝色花色构成机理和基因工程育种研究方面获得了大量的研究进展。综述了蓝色花构成的化学、生理学和分子生物学机理，利用基因工程技术培育蓝色花的育种实践：包括转入花青素苷合成途径上的关键酶基因，抑制内源竞争酶基因，转入液泡pH值调节基因和金属离子转运蛋白基因等。在这里基础上总结出几种蓝色花基因工程育种的基本策略，以期为蓝色花基因工程育种提供参考。 本文关键词语： 花青素苷; 转基因; 分子育种; Abstract： Blue flowers possess highly ornamental value,bu
2、t its coloration mechanism is very complicated. A great number of progresses have been achieved in the study of the pigmentation mechanism and genetic engineering in blue flower. Here the chemical,physiological,and molecular mechanisms of blue flower color are summarized. Many breeding practice for
3、blue flowers are reviewed,including overexpression of key enzyme genes on anthocyanin biosynthetic pathway,expressing inhibition of entogenous competitive enzyme genes,introduction of regulatory genes for vacuoles pH regulation,and overexpression of metal ions transporter genes. Several tactics of g
4、enetic engineering for blue flowers are summarized based on these breeding practices,aiming to provide the reference for the genetic engineering breeding of blue flowers. Keyword： anthocyanin; genetic transformation; molecular breeding; 花色是观赏植物最受关注的性状，新奇的花色是育种者始终追求的目的。长期以来杂交育种和突变选种是创造新花色的主要方式方法。花青素是
5、花瓣中普遍存在的花色素，能使花呈现从红到紫红到蓝的变化，花青素在胞质中合成，在液泡中积累1。在高等植物中花青素的生物合成从查尔酮开场到生成花青素3-葡萄糖苷的途径非常保守图1，且研究得比拟透彻1。根据对不同观赏植物花青素生物合成途径的认知，每个物种表示出特定的酶基因，只能积累有限种类的花青素苷，因而一个物种拥有全部种类的花色几乎是不可能的。例如，大宗贸易花卉月季、康乃馨和菊花均因不积累飞燕草素为核心的花青素苷而缺少紫色和蓝色的品种。培育蓝色珍贵花卉是几辈育种者多年的梦想，基因工程技术为花色育种者打开了一扇大门，使突破物种遗传背景限制，培育新奇的花色成为可能。蓝色花的育种一直是花色研究的热门，近
6、年来获得了大量的研究成果。这期间最突出的成就是月季、菊花、蝴蝶兰等重要花卉蓝色品种的诞生2,3,4。本文根据已有研究基础5,6总结了蓝色花构成的原因以及近15年蓝色花基因工程育种的基本策略及研究进展。 图1 植物花青素苷生物合成途径简图2 CHS：查尔酮合酶；CHI：查尔酮异构酶；F3H：黄烷酮3-羟化酶；F3 H：类黄酮3 -羟化酶；F3 5 H：类黄酮3 ,5 -羟化酶；DFR：二氢黄酮醇4-复原酶；ANS：花青素合成酶；GT：花青素葡萄糖基转移酶；MT:S-腺苷甲硫氨酸：花青素苷甲基转移酶；AT：花青素苷酰基转移酶；FNS：黄酮合成酶；FLS：黄酮醇合成酶 1、 蓝色花构成的化学和生理基
7、础 1.1、 蓝色花色素 蓝色花最主要的成因在于花青素的化学构造，蓝色花瓣中含有的花青素通常被甲基化、糖苷化和酰基化修饰，被芳香酸如对-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、对-羟基苯甲酸等多重酰基化是蓝色花中最主要的花青素苷酰基化修饰，芳香酸酰基与花青素构成 三明治 型的分子内堆叠，这使得花青素苷蓝化且愈加稳定7,8。酰基化修饰的位置也非常重要，通常在花青素3 -和/或7-位上发生芳香酸酰基化比3-和/或5-位上的芳香酸酰基化对于蓝色的构成更为重要9。大多数蓝色花主要含有飞燕草素糖苷及其酰基化衍生物，极少数的蓝色花以酰基化的矢车菊素糖苷或矮牵牛素糖苷为主。以飞燕草素为主的蓝色花典型代表有鸭跖草Commel
8、ina communis、飞燕草Delphinium spp.、龙胆Gentiana spp.、鼠尾草Salvia spp.、蝶豆花Clitoria ternatea、风信子Hyacinthus orientalis等7,10,11。以酰基化矢车菊素糖苷为主的蓝色花有矢车菊Centaurea cyanus、圆叶牵牛Ipomoea purpurea、绿绒蒿Meconopsis spp.等7,12,13,14。以酰基化矮牵牛素糖苷为主的蓝色花以琉璃唐草Nemophila menziesii为代表7,15。 鸭跖草、矢车菊、鼠尾草、琉璃唐草的蓝色色素为金属络合花青素苷Metalloanthocyan
9、ins，即花青素苷、黄酮和金属离子以662的化学计量比自络合构成的超分子金属络合色素7。在以飞燕草素为发色团的超分子金属络合色素中，Mg2+对稳定蓝色的作用是足够的；在以矢车菊素或矮牵牛素为发色团的金属络合色素中，除了Mg2+以外，还需要1/6当量的Fe3+辅助7。然而，自然界中含有金属络合花青素苷的蓝色花却非常少。通常的蓝色花中以非化学计量比存在的金属离子对花青素苷起到辅助着色的作用，这些蓝色色素稳定性较差，在分离色素或结晶的经过中蓝色便消失了7。例如，大花绿绒蒿Meconopsis grandis的色素组成为1当量的矢车菊素糖苷，2或更多当量的山奈酚衍生物黄酮醇，1/6当量的Fe离子和过量
10、的Mg2+16。 1.2、 蓝色呈现所需要的液泡环境 很多体外试验表示清楚，有了蓝色花青素如飞燕草素及其衍生物通常不一定呈现蓝色，可见液泡内的环境包括p H值、有机物和无机物的组成和含量等对蓝色花的构成尤为重要。以绣球花为例，红色、紫红色、蓝色等花中均只含有飞燕草素3-葡萄糖苷。进一步研究发现，蓝色品种花瓣的pH值、5-O-乙酰奎宁酸与花青素苷的摩尔比率，以及Al3+的摩尔当量都显着高于红色细胞17,18。郁金香品种Murasakizuisho内层花瓣基部因大量积累铁离子，与飞燕草素3-芸香糖苷作用而呈蓝色19。牵牛花Ipomoea tricolor cv.Heavenly Blue在花蕾期为
11、紫红色，完全开放为蓝色，其所含色素为紫红色的咖啡酸酰化芍药花素糖苷，没有金属离子络合。在花蕾期液泡pH值为6.6，完全开放期液泡pH值上升为7.720。 当前蓝色花构成的化学和生理机制尚未完全解析，根据已有研究结果，蓝色花构成的因素主要有：1蓝色花青素的生成；2花青素苷的多重芳香酸酰化；3黄酮、黄酮醇等辅助色素介入；4金属离子络合；5较高的液泡pH值等。 2、与蓝色花构成相关的基因 2.1、 与蓝色色素合成相关的酶基因 在高等植物中，从查尔酮到花青素-3-葡萄糖苷的生物合成途径非常保守，从花青素-3-葡萄糖苷之后的进一步糖苷化、酰基化修饰方式在不同植物中变化多样，因而蓝色花的花青素苷合成途径尚
12、未完全说明。已经知道的几种介入蓝色花青素合成的关键酶中，细胞色素P450氧化酶家族CYP75A或CYP75B亚家族的类黄酮3 ,5 -羟化酶F3 5 H催化二氢山奈酚B环上的3 -和5 -位的羟基化生成二氢杨梅素，是合成飞燕草素的前体。由于单一积累飞燕草素糖苷及其多酰基化的衍生物被育种者以为是培育蓝色花最有效的手段，因而F3 5 H基因最受关注，并已从多种植物中克隆并鉴定21。而抑制蓝色花本身的F3 5 H基因表示出，可导致花色变成紫红色，如龙胆22。 二氢黄酮醇4-复原酶DFR催化二氢黄酮醇生成无色花青素苷元Leucoanthocyanidins。不同植物中DFR的底物专一性影响了花瓣中最终
13、积累的花青素苷元B环上的羟基化程度。例如，矮牵牛、大花蕙兰等的DFR只能催化二氢槲皮素和二氢杨梅素，不能催化二氢山奈酚9。因而这些植物的DFR对于专一性地合成飞燕草素是有利的。 花青素的糖苷化和酰基化修饰对于维持其颜色的稳定非常重要，也是蓝色花色素最常见的构造修饰方式。迄今鉴定出的花青素糖苷化酶有两类，一类是依靠UDP-糖的糖苷化酶家族1，另一类是依靠酰基-葡萄糖的花青素糖苷化酶9。已鉴定的花青素苷酰基转移酶也分为两类，一类是利用酰基-CoA为供体，将酰基转移至花青素苷糖基部分的特定位置；另一类是类丝氨酸羧肽酶SCPL-酰基转移酶，利用酰基葡萄糖作为供体分子，催化花青素苷糖基部分的酰基化9。飞
14、燕草的糖基转移酶基因AA7GT或酰基转移酶基因AA7GT-AT发生突变，均可产生由于积累中间产物而导致粉色或者红色的花色表型23。 2.2、 细胞pH值调控基因 矮牵牛花瓣中鉴定出7个调控pH值的基因位点PH1-PH724。华而不实PH5编码一种定位于液泡膜的H+P3A-ATPase质子泵。当PH5基因发生突变时，液泡中的pH值升高，花瓣从紫红色变成蓝紫色25。PH1基因突变体的花色与PH5基因突变体颜色类似，PH1编码的P3B-ATPase可与PH5编码的H+P3A-ATPase物理性结合，促进H+转运活性，增加液泡的酸化程度26。裂叶牵牛Ipomoea nil开花经过中InNHX1和InN
15、HX2基因编码的转运蛋白将K+/Na+转运至液泡，提高液泡pH值，使花色变蓝27,28。 2.3 、金属离子转运蛋白基因 从郁金香中分离鉴定了一种编码液泡铁离子转运蛋白的基因TgVit1，其编码蛋白具有促进液泡中铁离子的积累，与飞燕草素3-芸香糖苷作用呈现蓝色的功能29。随后在矢车菊中鉴定了与TgVit1同源的基因CCViT30。绣球花中分离鉴定了编码液泡膜和质膜定位的Al离子转运蛋白的基因VALT和编码质膜Al离子转运蛋白1的基因PALT1，这些基因编码的Al离子转运蛋白与Al离子介入蓝色绣球花花色的构成有关31。 3 、蓝色花卉基因工程育种实践与策略 当前，育种者利用基因工程技术培育蓝色花
16、主要有下面几方面的实践表1。 3.1 人工创造飞燕草素合成途径 尽管矢车菊、绿绒蒿等蓝色花是由矢车菊素糖苷与金属离子构成络合物而呈蓝色，含有芍药花素糖苷的牵牛花由于细胞内pH值升高而产生蓝色，但是，大多数蓝色花的成因是积累大量的飞燕草素。而很多缺少蓝色花色的植物如康乃馨、月季、菊花、百合、蝴蝶兰等21,32就是由于本身缺乏飞燕草素合成途径上的关键基因F3 5 H。因而通过转基因技术，向不含飞燕草素的花卉植物中，转入外源F3 5 H基因促进飞燕草素的生成，是全世界公认的最有可能获得蓝色花的手段。 3.1.1、 转基因受体的挑选原则 转基因受体要有适宜的遗传背景和类黄酮组成4。转入外源F3 5 H
17、后，能否将F3 5 H酶的产物二氢杨梅素转化成飞燕草素非常关键，即首先要检测转基因受体DFR酶能否具有催化二氢杨梅素能力，如没有则要转入外源的DFR基因。还要考虑受体植物内源的DFR、F3 H和FLS酶对F3 5 H酶底物的竞争。要避免底物竞争，最好有这些竞争基因功能缺失的天然突变体，或者通过基因工程手段如RNAi等下调这些基因的表示出。除此之外，尽量选择花瓣pH值较高、黄酮/黄酮醇含量较高的材料21。这样才有可能获得较理想的蓝色花表型。 3.1.2 、单一转入外源F3 5 H基因 国内外学者对转入外源F3 5 H基因做了大量的尝试。将洋桔梗Eustoma grandiflorum)F3 5
18、H基因转入烟草，转基因烟草最多仅积累了23%的3 ,5 -羟基化的花青素苷，花色有所加深33。Tanaka21将三色堇Viola sp.cultivar black pansy)F3 5 H基因转入后使月季最多产生了60%的飞燕草素糖苷，花色变成深红色。堇菜Viola spp.)F3 5 H基因在月季品种Lavande中过表示出，最多可产生44.2%的飞燕草素，然而有三分之二的转基因株系的飞燕草素含量少于20%，花色变化不明显4。蔓长春花Vinca major)F3 5 H基因VmFH1在红色矮牵牛中过表示出，产生了深红色带深紫色扇形区域的花色表型34。风铃草Campanula medium)
19、F3 5 H基因在烟草中异源表示出能够特异性积累飞燕草素最多达99%，花色也变成新奇的紫色35。蝶豆花F3 5 H基因转入马鞭草植株后，比过表示出马鞭草F3 5 H基因的植株产生的表型变化更明显，花色由粉红色变成紫红色36。将蝴蝶兰Phalaenopsis)F3 5 H基因在矮牵牛花中过表示出，使花色由粉色变成深粉色；蝴蝶兰F3 5 H基因在东方百合Sorbonne花被片中瞬时过表示出，产生了紫色的细胞37。日本Florigene公司将三色堇Viola sp.cultivar black pansy)F3 5 H基因在非洲菊中过表示出，能够积累50%的飞燕草素糖苷，花色也发生了一定的变化8。日
20、本千叶大学Mii教授等6将鸭跖草Commelina communis)F3 5 H基因转入大丽花，转基因植株产生了飞燕草素衍生物，花色呈现蓝紫色6,32。Mii教授等还将鸭跖草F3 5 H基因转入了蝴蝶兰，由于粉色蝴蝶兰花瓣中主要花青素为7-位和3 -位多重糖苷化和芳香酸酰化的矢车菊素，因而单独过表示出矢车菊F3 5 H基因的蝴蝶兰很容易生成多重酰基化的飞燕草素，呈现出非常接近蓝色的花色6,32。 Brugliera等38将三色堇Viola sp.cultivar black pansy)F3 5 H基因在菊花中过表示出，产生40%的飞燕草素糖苷，使花瓣颜色转蓝，然而所产生的花色并不新奇，已有
21、育种者用传统手段育成类似的花色。Noda等39挑选出菊花中高效驱动外源F3 5 H表示出的启动子为菊花F3H(CmF3H启动子，在这里启动子驱动下，带有烟草NtADH基因5 UTR序列的风铃草F3 5 H基因过表示出能产生更多的飞燕草素到达95%，花色也呈现出了蓝紫色。 表1 已有的培育蓝色花转基因育种策略及获得的花色表型 注：P：启动子 以上结果表示清楚，F3 5 H基因的来源以及其转化的受体对改变花色的结果都非常重要，因而需要挑选合适受体植物的外源基因和启动子。然而通常仅转入外源F3 5 H基因固然能在目的植物花瓣中产生飞燕草素，却往往并不能到达令人满意的蓝色效果。 3.1.3、外源F3
22、5 H基因与其它关键酶基因同时转入 3.1.3.1、与DFR基因同时转入 将外源F3 5 H基因和DFR基因同时转入创造蓝色花最经典的实例就是蓝紫色的 Moon 系列康乃馨的诞生。以散枝型DFR和F3 H突变体白花品种White Unesco为转基因受体，转入矮牵牛F3 5 H基因和DFR基因，获得了完全积累飞燕草素的浅紫色品种FLORIGENEMoondust，这是世界上首个商业化的转基因观赏植物21。随后发现三色堇Viola sp.cultivar black pansy的F3 5 H基因在康乃馨中表现更好，将其与矮牵牛DFR-A基因同时转化DFR突变体品种Unesco，产生了比Moond
23、ust积累更多飞燕草素的深紫色品种FLORIGENE Moonshadow，其花瓣中含有一种芹菜素C-苷作为辅助色素，且花瓣的pH值更高层次，使花色看起来更蓝40。采用同样的策略育出了FLORIGENE Moonvista、FLORIGENE Moonshade、FLORIGENE Moonlite、FLORIGENE Moonaqua等诸多商业品种21。 月季品种Lavande中，同时过表示出堇菜Viola spp.)F3 5 H基因和鸢尾Iris hollandica)DFR基因比单独过表示出堇菜F3 5 H基因积累了更多的飞燕草素，最高可达75%4。蝴蝶兰F3 5 H基因与风信子Hyac
24、inthus orientalis Sky Jacket )DFR基因同时在矮牵牛中过表示出比蝴蝶兰F3 5 H基因单独过表示出能积累更多的飞燕草素糖苷，在东方百合花被片中瞬时过表示出这两个基因比单独过表示出F3 5 H基因产生颜色更紫的细胞37。 3.1.3.2、与花青素苷修饰酶基因同时转入 除了改变受体植物的花青素苷元构造生成飞燕草素外，学者们也对飞燕草素糖苷的芳香酰基化修饰进行了尝试。将堇菜Viola spp.)F3 5 H基因和夏堇Torenia hybrid cultivar Summer Wave Blue)5AT花青素苷5-羟基肉桂酸酰基转移酶基因共同转化不同花色的月季品种，结果
25、显示各品种转基因株系都不同程度地积累了飞燕草素糖苷，花色也发生了不同程度的蓝化。只要一些不超过44%花青素苷被夏堇的5AT酶酰基化，且5-位酰基化只能使花青素苷的最大吸收波长红移4 nm，因而很难观察到由酰基化产生的花色变化4。 由于单独转化风铃草F3 5 H基因得到的菊花花色并不是纯正的蓝色39，为了让菊花能像蝶豆花一样积累3 -位和5 -位被糖苷化的飞燕草素糖苷，研究者进一步将蝶豆花的UDP-葡萄糖：花青素苷3 ,5 -O-葡萄糖基转移酶基因CtA3 5 GT与风铃草F3 5 H基因同时转入菊花，成功生成了飞燕草素3 ,5 -双糖苷化的衍生物，在木犀草素7-丙二酰葡萄糖苷辅助着色作用下，使
26、花瓣呈现了纯正的蓝色5。应用这种方式方法实现了各种花型蓝色菊花的培育32。 3.1.3.3、与辅助基因同时转入 矮牵牛的一种在花中特异表示出的基因difF，因其编码一种细胞色素b5蛋白能够加强F3 5 H酶活性41，在蓝色花育种中可作为F3 5 H基因的辅助基因，同时转化目的植物。FLORIGENE公司向缺少F3 H酶活性积累天竺葵素的红色康乃馨品种Cerise Westpearl中，同时转入矮牵牛F3 5 H基因Hf1和difF，获得了深紫色的品种FLORIGENE Moonvelvet在美国上市21。在东方百合中同时瞬时表示出蝴蝶兰F3 5 H基因和矮牵牛difF基因，然而被转化细胞颜色没
27、有发生变化37。 3.1.4、转入外源基因同时抑制内源关键酶基因 FLORIGENE公司利用RNAi技术抑制康乃馨红色品种Cerise Westpearl内源DFR基因表示出，并转入三色堇Viola sp.cultivar black pansy)F3 5 H基因和矮牵牛DFR基因，产生了紫色品种FLORIGENEMoonberry和浅紫色品种FLORIGENE Moonpearl，均已上市21。 抑制月季品种Lavande的DFR基因，同时转入堇菜Viola spp.)F3 5 H基因和鸢尾Iris hollandica)DFR基因，2/3的转基因株系中积累超过80%的飞燕草素，最高可达98
28、%，成功地使月季中花青素代谢流从矢车菊素合成途径转向了飞燕草素合成途径，花色由浅紫红色变成了蓝紫色4。至此蓝色月季Applause诞生了，并于2018年上市21。然而Applause花色还是偏向紫色，接下来将从增加辅助色素和调节液泡pH值等方向进一步改进21。不久前完成的月季基因组测序获得了当下植物基因组中质量最高的基因组信息，通过重建次生代谢及其调控通路，提出了月季花色和花香关联的调控模型，为进一步说明月季花色分子机制提供了基础，能够加速月季、蔷薇科物种及其他观赏植物的花色改进育种42。 菊花中F3 H基因是矢车菊素合成途径的关键因，为了使花青素向飞燕草素合成途径转变，Huang等43采用R
29、NAi技术抑制菊花CmF3 H的表示出，且过表示出瓜叶菊Senecio cruentus)F3 5 H基因PCFH，然而瓜叶菊F3 5 H酶在菊花中仅表现出3 -羟基化的功能，使转基因菊花中的矢车菊素含量显着增加。Brugliera等38尝试了利用hairpin RNAi(hp RNAi干扰菊花CmF3 H的表示出，同时转入三色堇Viola sp.cultivar black pansy)F3 5 H，使转基因菊花中积累达80%的飞燕草素糖苷，花色由粉色变为紫色。 3.2 、增加辅助色素含量 Aida等44研究一系列夏堇的转基因植株发现，转入反义DFR基因的花色比转入反义CHS基因的花色更蓝。
30、原因是DFR基因功能受抑制导致辅助色素黄酮的含量显着增加，因此使花色更蓝。这一方式方法可应用于其它植物蓝色花的育种。 3.3 、提高液泡pH值 尽管已育成的蓝色月季中积累了足够多的飞燕草素，但是由于花瓣细胞液泡酸度过高，花色仍然呈现出一定程度的红色色调4。因而要使花瓣呈现蓝色，转入基因创造一个pH值5.6-6.2微酸性的液泡环境，或者选择天然具有较高pH值的受体材料尤为重要32。例如，由细胞培养得到的突变体培育而成的紫色仙客来主要含有锦葵素3,5-二葡萄糖苷，在这里基础上，通过隐性突变提高花瓣细胞pH值有望获得蓝色仙客来32。 3.4 、增加金属离子含量 在紫色郁金香花被片细胞中瞬时过表示出液
31、泡铁离子转运蛋白基因TgVit1，使铁蛋白合成基因TgFER受抑制，阻止铁蛋白积累并结合铁离子，使细胞变蓝29,45。进而Shoji等46又利用花瓣特异表示出的TgMYB1启动子驱动TgVit1基因的表示出，期望获得蓝色郁金香。除此之外，Kurihara等47将TgVit1在积累飞燕草素3,5-二葡萄糖苷的突变体仙客来中瞬时表示出，获得了蓝色细胞，有望通过稳定表示出得到蓝色仙客来。 3.5 、蓝色花卉基因工程育种策略 综合上述蓝色花育种实践，如要成功地利用基因工程创造有商业价值的花卉需要具备下面条件：1分离到有效的基因；2建立高效的目的植物遗传转化体系；3通过启动子序列、目的基因的来源和终止子
32、序列等方面来优化目的基因的表示出；4选择遗传背景适宜的受体品种21。根据蓝色花构成的因素，创造蓝色花应从下面方面入手：积累飞燕草素糖苷，其糖基被芳香有机酸酰化，或者加强花青素苷与辅助色素、和/或金属离子之间的互相作用。 4、 小结 尽管诸多育种实践证实了通过基因工程的手段创造蓝色花的可行性，然而让目的植物特异地大量积累某一类色素并呈现蓝色非常困难。首先需要考虑蓝色花青素苷通常有复杂的糖苷化和酰基化修饰，这些修饰酶在异源植物中的活性能否能够正常发挥，还需要考虑调节液泡pH值以及有辅助色素和金属离子共存，这就需要对目的植物的花色构成机制有全面的认识。近年来日趋普及的全基因组测序工作将为全面解析植物
33、花色构成的机制奠定坚实基础。除此之外，对于非形式植物来讲，很多观赏植物普遍存在遗传转化效率低、童期长、转入基因表示出变异大等问题，攻克这些难题才有希望获得更多新奇的商品化的蓝色花卉。 以下为参考文献 1Tanaka Y, Sasaki N, Ohmiya A. Biosynthesis of plant pigments:anthocyanins, betalains and carotenoidsJ. Plant Journal, 2008,54:733-749. 2徐清燏,戴思兰.蓝色花卉分子育种J.分子植物育种,2004, 2(1):93-99. 3欧阳汝欣.蓝色花的基因工程育种研究进展
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