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1、梅毒螺旋体的实验室常见的诊断方法综述,性医学论文梅毒危害极大,在我们国家曾一度被消灭,但随着近年来对外沟通的日益频繁又死灰复燃,发病率呈逐年上升趋势。2020 年国家卫生部颁布的甲、乙类法定报告传染病中,梅毒发病率较 2018 年上升 3. 27%,死亡率上升 5. 36%,应引起重视。因而早期检出患者,及时治疗,控制传染源,是控制梅毒传播的重要措施。梅毒检测方式方法有多种,现就梅毒螺旋体的实验室常见的诊断方式方法作一扼要综述。 1、 病原体的检测 对患者分泌物进行观测,如发现运动的苍白螺旋体即可确诊为梅毒,该方式方法特异性高,但灵敏度稍低,容易漏检。梅毒检测适用于早期梅毒皮肤黏膜损害,对硬下
2、疳尤为重要,由于人体感染 TP 3 6 周后,才能通过梅毒螺旋体抗原血清试验( TPHA) 、梅毒荧光抗体( FTA) 等敏感性、特异性较高的方式方法检测到血清中的抗体,在患者血清抗体到达可测水平之前,TP 检查是早期诊断梅毒最好的方式方法。 1. 1 暗视野显微镜( DF) 检查梅毒螺旋体暗视野检查法是梅毒病原体检测的主要方式方法。在皮损处,用玻片刮取组织渗出液或淋逢迎穿刺液,用 500 暗视野显微镜观察,在暗背景上,梅毒螺旋体呈白色发光、运动快速、急促,可以较缓慢地围绕长轴旋转。根据其典型的形态、大小和运动方式,结合临床异常感觉和状态可直接诊断梅毒。暗视野检查法特异性高,适用于早期梅毒的诊
3、断。但由于受病程、取材、检测人员技术水平以及部分患者不规则使用抗生素导致 TP 数量减少和活动力下降的影响,敏感性较低为 54. 4%,因而此法检查阴性也不能排除患梅毒的可能。该法简单、快速,但不适用于潜伏及晚期梅毒患者。且口腔中可能存在其他螺旋体,因而此法对口腔病灶材料亦不适用。 1. 2 活体组织检查梅毒螺旋体 常用银染色法( war-thin-starry) 或直接荧光抗体试验( DFAT) 检查活体组织梅毒螺旋体。银染色法能使梅毒螺旋体染成棕褐色或黑褐色,形态清楚明晰易辩,且标本能够永久保存。但由于存在梅毒螺旋体类似物质的干扰,因而,银染色阳性结果的判定应慎重。特异性荧光抗体试验是用非
4、致病性螺旋体培养物对抗梅毒螺旋体抗血清或单克隆抗体吸收后,再与异硫氰酸荧光素( FITC) 相结合,在荧光显微镜下判读结果。梅毒螺旋体发特异性黄绿色荧光,灵敏性稍高于暗视野检查法。可用于梅毒螺旋体与类似螺旋体的鉴别。 1. 3 多功能超高倍显微诊断仪( MDI) 是一种集光学、光电学、电子学、医学影像学和多媒体计算机技术于一体的高科技医学显微设备,其具有共轭变焦、高清楚明晰度、高分辨率、高放大倍率的特点,有效放大倍率可达 20 000 倍以上。能够快速、便捷的进行标本观测。 其在期梅毒诊断的阳性率为 83. 75 %,但由于设备昂贵难以普及。 2、 梅毒血清学检查 机体感染梅毒螺旋体后可产生两
5、种抗体,一种是抗梅毒螺旋体的特异性抗体( IgM 和 IgG) ; 一种是非梅毒螺旋体特异性的抗体,即反响素。梅毒血清学检查包括非梅毒螺旋体抗体检测( 非特异性抗体检测)和特异性梅毒螺旋体抗体检测。前者敏感性、特异性均较后者低,但由于抽血后 1 h 即可出结果,费用也低廉,因而常用于临床挑选。并且非特异性抗体在治疗后下降或消失,因而可断定治疗效果。后者敏感性和特异性均较高,主要用于确认试验,但由于其不随治疗下降或消失,故不能用于断定治疗效果。 2. 1 非梅毒螺旋体血清试验 非梅毒螺旋体血清试验检测的为非特异性抗体( 反响素) ,某些其他疾病患者如结核、红斑狼疮、类风湿性关节炎、猩红热等甚至健
6、康人中可以出现反响素,因而可出现生物学假阳性。 除此之外,标本溶血或容器污染等亦可引起假阳性反响,其特异性较低。经治疗后患者反响素可消失或阴转,通常用于疗效观察、判定复发及再感染。 2. 1. 1 性病研究实验室试验( VDRL) : 以心磷脂、胆固醇及卵磷脂的混悬液作为抗原,与机体产生的反响素在体外发生反响。属于微量玻片法,操作简单、快速,对诊断神经梅毒有重要价值,敏感性可达 99%,特异性达 70. 8%。可作定量及定性试验,但对一期梅毒敏感性低。 2. 1. 2 快速血浆反响素环状卡片试验( RPR) : VDRL试验的改进。用标准活性炭颗粒吸附 VDRL 抗原,操作简单、快速,结果易于
7、观察,灵敏度较 VDRL 高,是当前临床应用最多的检测方式方法之一。RPR 可检测滴度,滴度可在治疗后半年到 2 年下降 4 倍,滴度变化是观察治疗效果、复发或再感染的重要指标。RPR 试验和DF 方式方法相结合,可早期诊断梅毒。其缺点是反响素水平过高可产生假阴性结果。该法对神经梅毒、潜伏期梅毒不敏感。 2. 1. 3 不加热血清反响素玻片试验( USR) : 为改进的VDRL 试验,待检血清不需加热灭活,直接在玻片上进行絮状反响,肉眼判读结果。此法敏感性高而特异性较低,易发生生物学假阳性,亦可作为疗效观察、判定复发或再感染的指标。 2. 1. 4 甲苯胺红不加热血清实验( TRUST) :
8、其原理是以甲胺苯红染料颗粒代替炭颗粒作为指示物,当液体中出现凝集程度不同的红色凝块时即判为阳性,简便快速,结果判读以白色纸卡为背景,清楚明晰易判,稳定性好。对于非梅毒螺旋体特异性抗体的检测,TRUST法的检出率和重复性均优于 RPR 法。但由于在梅毒感染的早期和潜伏期,血清中反响素很少,其检出率亦较低,分别为 72. 7%和 73. 7%。 2. 2 梅毒螺旋体血清试验 此类试验采用的抗原是梅毒螺旋体或其成分,检测血清中的抗梅毒螺旋体IgM 和 / 或 IgG 抗体,其敏感性和特异性均较高,一般用作确证试验。但由于特异性 IgG 抗体可终身存在,因而不能用作疗效观察。 2. 2. 1 梅毒螺旋
9、体血球凝集试验( TPHA) : 该法使用甲醛处理的羊红细胞做抗原载体,吸附从兔睾丸中提取后经超声波粉碎的 Nichols 株梅毒螺旋体菌体抗原,检测血清中抗梅毒螺旋体特异性抗体。为排除非特异性反响,待测血清需经吸收剂( 兔睾丸提取物、正常兔血清及超声处理的密螺旋体无毒株 Reiter 株) 吸收,因而 TPHA 具有高度的敏感性和特异性,是当前临床常用的梅毒血清学确证试验。其缺点是抗原制备困难,试剂较昂贵,操作较繁琐,且易发生自凝现象。 2. 2. 2 梅毒螺旋体明胶凝集试验 ( TPPA) : TPPA 与TPHA 不同的是用明胶颗粒代替羊红细胞做抗原载体,吸附梅毒螺旋体 Nichols
10、株菌体抗原,进而避免了TPHA 法血球易自凝而造成的漏诊。TPPA 敏感度和特异性均较高,分别为 99. 2% 和 97. 0%,在临床上亦常用于梅毒血清学确证试验。该法操作简便、快速,结果易于判定,但同样由于试剂价格较昂贵而使其在临床的大规模使用遭到限制。 2. 2. 3 荧光密螺旋体抗体吸收试验( FTA-ABS) : 是一种间接荧光抗体法,其先以密螺旋体无毒株( Reiter株) 超声裂解抗原吸收待检血清,除去具有穿插反响的抗体,再与梅毒螺旋体菌体作用,然后参加荧光素标记的抗人 IgG。此法敏感性、特异性均较高,文献报道FTA-ABS 对各期梅毒检测的特异性到达 92% ,对一期梅毒敏感
11、性为80%,二期为99% 100%,三期为95% 100%,亦常被用做确证试验。FTA-ABS-19S-IgM试验是先将血清中 IgG 和 IgM 分离,再用 FTA-ABS 法检测 19S-IgM 抗体,避免了母体 IgG 的干扰,常用于新生儿先天梅毒血清学的诊断试验,是早期确诊先天梅毒的重要手段。其缺点在于步骤繁琐,操作费时,结果判读易受操作人员经历体验的影响。 2. 2. 4 快速乳胶凝集试验( syphilis fast test) : 本试验是将梅毒螺旋体 TpN15、TpN17 与 TpN47 重组抗原结合到乳胶颗粒上,当血清中存在特异性梅毒螺旋体抗体时,即可发生凝集反响。其与 T
12、PPA 一致率可达98. 8% ,有一定的敏感性和特异性。该试验操作简单、快速,合适门诊梅毒检测。 2. 2. 5 梅毒螺旋体免疫印迹技术( WB) : 该法将免疫学的特异性和分子生物学的灵敏性相结合,具有敏感性高、特异性强的特点。Byrne 等用免疫印迹法检测梅毒螺旋体抗体时,以为只要当 15. 5、17、44. 5、47 kDa 4 个抗原中的 3 个被检测到才能判定为阳性,其敏感性为 98%,特异性为 100%。诊断梅毒的灵敏性优于 FTA-ABS 约 3 4 个血清稀释度。对神经性梅毒检测的阳性率为 100%。此法操作简便,特异性好,结果易判,但成本较高。 2. 2. 6 梅毒螺旋体酶
13、联免疫吸附试验( TP-ELISA) :是将梅毒螺旋体 TpN15、TpN17 与 TpN47 重组抗原包被在微孔板上,采用双抗原夹心法检测梅毒螺旋体特异性抗体。其原理是利用包被的梅毒特异性抗原对血清中的抗体进行初筛,然后通过酶标记的特异性抗原再次进行挑选,因而增加了结果的特异性。该法可同时检测 IgM、IgG 抗体,缩短了窗口期,提早了对感染后的检出,十分是 TP-IgM 对早期梅毒、先天梅毒的诊断有重要意义。文献报道 TP-ELISA 方式方法的敏感性高于荧光密螺旋体抗体吸收试验( FTA-ABS),对一期梅毒的诊断灵敏度为 93. 8%,且生物学假阳性和假阴性发生率明显低于 RPR。该方
14、式方法操作简单,易于自动化,合适大批量样本检测,结果准确可靠,被公以为梅毒血清学诊断试验的首选方式方法。 2. 2. 7 梅毒胶体金法( ICS) : 金标法是一种快速体外诊断技术。应用基因重组技术制备梅毒螺旋体特异性基因工程抗原,采用胶体金标记和免疫层析技术,能够高度特异的检测待测血清中的抗体。可用于全血、血浆、血清的检测,灵敏度高,可用于梅毒的快速检测和相关筛查。胶体金法检测 TP-IgM 还可用于诊断梅毒复发和再感染的检测。 2. 2. 8 化学发光法( CMIA) : 将 TP 抗原包被到固体铁粒子上,使其与标本中的抗 TP 抗体反响,再与酶标抗人 IgG 抗体结合,构成抗原-抗体复合
15、物后,参加化学发光基质,根据化学发光基质的发光量可计算出标本中抗 TP 抗体的含量。Knight 等报导应用此法检测梅毒患者血清有很好的敏感性( 95. 8% 100%)和特异性( 99. 1% 100%) 。但由于试剂成本较高且需要特殊仪器,当前未在临床得到广泛应用。 3、 分子生物学技术 随着分子生物学技术的飞速发展,应用 PCR 技术检测梅毒螺旋体 DNA 已在临床得到应用。现 PCR 诊断梅毒的方式方法主要有常规 PCR、多重 PCR、实时荧光定量 PCR、RT-PCR( 反转录 PCR) 、巢式 PCR。Liu等应用 PCR 技术检测生殖器溃疡标本 polA 基因,敏感性为 95.
16、8%,特异性为 95. 7%。Leslie 等应用实时荧光定量 PCR 检测患者标本 polA 基因,敏感性为 80. 39%,特异性为 98. 40%。PCR 技术敏感性高,但存在难于标准化的问题,其原因主要是由于引物来源不同以及各实验室间 DNA 抽提方式方法存在差异不同,且临床标本成分复杂,也进一步导致了该法难于标准化。 所以建立对梅毒螺旋体高度特异的 PCR 方式方法尤为重要。PCR 技术是梅毒血清学试验的有益补充,在早期梅毒诊断中发挥重要作用。 综上所述,应根据研究目的选择恰当的试验方式方法。 当前,国内实验室在进行梅毒常规筛查及疗效观察、判定复发及再感染时常采用梅毒非特异性血清学试
17、验( RPR、TRUST 等) ; 各期梅毒确实诊试验常采用梅毒的特异性血清学试验( TPPA、TPHA 等) ; 进行大规模梅毒筛查常采用双抗原夹心法 ELISA。随着检测技术的迅速发展,必将提供应愈加简便、快速、准确、低成本的梅毒诊断试剂,使梅毒患者得到早诊断、早治疗,进而全面控制梅毒的流行。 以下为参考文献: 1 Krause W. Syphilis. Urologe A,2006,45: 1494-1500. 2 曾志良,段逸群,陈春梅. 一期梅毒患者梅毒螺旋体和血清学检测.中国皮肤性病学杂志,2002,16: 107-108. 3 朱慧兰,徐广坤,武明昌,等. 多功能显微诊断在期梅毒诊断中临床价值的初步评价. 中国麻风皮肤病杂志,2001,17: 33.