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1、探讨胸苷激酶基因在垂体腺瘤治疗中的作用机制,肿瘤学论文垂体腺瘤可导致相关激素的过度分泌和占位效应，进而引发多种临床异常感觉和状态。转基因动物和细胞转染实验证实，生长激素GHmRNA在垂体细胞中严格表示出且转录活性较高,而单纯疱疹病毒胸苷激酶HSVGTK与更昔洛韦共同作用已被证实可杀死多种肿瘤细胞。本文讨论TK基因在垂体腺瘤治疗中的作用及其机制。 1 材料和方式方法 1.1 实验材料 垂体生长激素腺瘤细胞系GH3由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供。腺病毒载体AdGHTK表示出试剂盒购自上海吉马制药技术有限公司，核苷类似物更昔洛韦购自湖北科益药业股份有限公司。兔源多克隆HSVGTK抗体、H
2、RP标记的goatantiGrabbitIgG购自北京博奥森公司。非放射性细胞增殖检测试剂盒购自武汉天源生物技术有限公司。 1.2 实验方式方法 1.2.1 细胞培养 用含有体积分数0.05磷酸盐缓冲液PBS的Optimem培养液，在37、体积分数0.05的CO2培养箱中培养GH3细胞。待细胞增殖至对数生长期，用于下面研究。 1.2.2 TK基因表示出检测应用免疫印迹法。取对数生长期细胞，按1.5 109/L的密度接种于6孔板中，培养24h后,按感染复数MOI为10PFU/cell转染细胞，对照组替换成等量PBS溶液。细胞转染48h后,使用PBS冲洗细胞两次，再将细胞置于0.3mL的缓冲液中。
3、将样品在干冰乙醇浴中冷却后置于37水浴，重复3次。4离心20min,上清液置于-70。 裂解细胞，提取蛋白，十二烷基硫酸钠G聚丙烯酰胺SDSGPAGE凝胶电泳后将蛋白质电转到硝酸纤维素膜上；用含50g/L脱脂奶粉的TBST常温封闭2h后,参加一抗兔源多克隆HSVGTK抗体1800,4孵育过夜，TBST缓冲液漂洗10 min共3次后，参加二抗HRP标记的goatantiGrabbitIgG,常温1h;TBST缓冲液漂洗10min共3次;显色，压片，显影，定影。 1.2.3 更昔洛韦敏感性检测应用非放射性细胞增殖检测试剂盒，测定转染过腺病毒的细胞对更昔洛韦的敏感性。取对数期细胞，以4 106/L的
4、密度接种于96孔板中，然后按不同的MOI0、1、5、10、100和500PFU/cell转染腺病毒载体。转染16h后，汲取病毒溶液，PBS清洗细胞，再添加不同浓度的更昔洛韦0、1、5、10mg/L，每隔2d添加一次含有更昔洛韦的培养液。在添加更昔洛韦后的第4天测定细胞存活率，实验重复3次。细胞存活率=给予更昔洛韦细胞的吸光度/未给予更昔洛韦细胞的吸光度。 1.2.4 旁观者效应将转染了AdGHTK的GH3细胞和未经转染的GH3细胞分别以14、23、32和41的比例混合后，以4 106/L的密度接种于96孔板中。培养1d后,华而不实一组参加浓度为10mg/L的更昔洛韦作为实验组，另一组参加等量P
5、BS作为对照组，每隔2d添液一次。4d后检测细胞的存活率。细胞存活率=细胞总数-死亡细胞数/细胞总数 100%. 1.3 统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料结果用x s表示，数据间比拟采用析因设计的方差分析及成组设计的方差分析，以P 0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 TK基因的表示出 AdGHTK转染组有两条明显的蛋白条带，相对分子质量分别为42000和46000;而对照组则仅有1条带，相对分子质量为42000图1。TK基因已转染入GH3细胞，并成功表示出。【图1】 2.2 TK基因对更昔洛韦敏感性影响 不同更昔洛韦浓度细胞存活率比拟，差异有显着性F=1
6、48160.215,P 0.001;不同MOI浓度细胞存活率差异亦有显着性F=275838.795,P 0.001;更昔洛韦浓度和MOI浓度间存在着显着的交互效应F=14245.000,P 0.001.当MOI浓度为0时,细胞存活率不随更昔洛韦浓度的变化而变化；当MOI浓度为1500PUF/cell时,细胞存活率随更昔洛韦浓度的增加而降低；当MOI浓度为10PUF/cell时,更昔洛韦浓度为1mg/L就产生细胞毒性细胞存活率明显下降；当更昔洛韦浓度为10mg/L时，细胞产生完全毒性细胞死亡率接近100%.转染细胞存在明显的敏感性。在高浓度MOI100、500PUF/cell下，即便更昔洛韦剂量
7、很低，也会产生明显的细胞毒性。见表1.【表1】 2.3 旁观者效应 未转染组细胞存活率为98.51 2.16%,14混合转染组为51.32 2.34%,23混合转染组为11.23 2.07%,32混合 转 染 组 为 2.31 3.08%,41混合转染组为2.07 2.4%n=10.不同比例混合转染组细胞存活率比拟，除32混合转染组和41混合转染组差异无显着性外P 0.05,其他各组间差异均有统计学意义F=2934.37,P 0.05.细胞存活率随混合细胞中转染TK基因的阳性细胞比例增高而降低，当混合细胞比例为32时,细胞存活率接近于0.存在明显的旁观者效应。 3 讨论 垂体腺瘤通常为良性，但
8、药物治疗效果不佳，能够进行手术治疗。与其他恶性程度更高层次的肿瘤相比，术后残留的垂体肿瘤细胞不会迅速转移和复发。因而，通过基因治疗消灭残存余留肿瘤细胞成为一种前景广阔的垂体腺瘤治疗方式方法。 基因治疗作用机制是应用人工合成核苷类似物更昔洛韦激活TK基因进而使肿瘤细胞产生毒性，到达杀死肿瘤细胞的作用。肿瘤细胞内TK基因表示出的TK可催化更昔洛韦构成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下构成三磷酸更昔洛韦.后者可导致DNA合成障碍，进而减少肿瘤细胞的产生，到达消除肿瘤的作用.TK基因在肿瘤治疗方面具有明显优势，其诱导构成的三磷酸更昔洛韦仅对分裂期细胞产生毒性，而对正常细胞无毒性作用，其杀伤作用仅局
9、限于肿瘤细胞.这为其临床上治疗垂体腺瘤提供了可靠的理论根据. 根据GH基因在垂体生长激素细胞中特异性表示出的特点,本实验将TK基因转染入GH3细胞并成功表示出；转染TK基因细胞经更昔洛韦处理后，细胞存活率明显下降；即便在低MOI转染条件下，细胞存活率仍对更昔洛韦存在明显的剂量依靠性。固然体外转染TK基因的GH3细胞经更昔洛韦处理后可产生不同程度的细胞毒性，但体内不可能所有肿瘤细胞都感染TK基因。因而，旁观者效应测定显得尤为重要。已有研究结果证实，大鼠肝癌CBRH7919等细胞存在旁观者效应.本研究中旁观者效应实验结果表示清楚，即便转染了TK基因的阳性细胞只占细胞总数的20%,细胞存活率也明显降
10、低。这讲明，导入TK基因不仅能够有效杀死感染的阳性细胞，还可降低邻近未感染细胞的存活率，TK与更昔洛韦联用对GH3细胞存在明显的旁观者效应.而旁观者效应能够加速肿瘤细胞的死亡，进而到达减少肿瘤细胞的作用，但其详细作用机制仍有待进一步研究。 综上所述，利用腺病毒为载体，将TK基因导入垂体肿瘤细胞，可有效杀伤肿瘤细胞，抑制其生长，进而为垂体腺瘤的基因治疗提供了可靠的实验根据，并为垂体腺瘤的治疗方案研究创始了一个崭新的视角。 以下为参考文献 1LIRASA,CRENSHAW EB,GLASSCK,etal.IdentificaGtionofratgrowthhormonegenomicsequenc
11、estargetingpituiGtaryexpressionintransgenic miceJ.Proc NatlAcadSciUSA,1988,8513:4755G4759. 2ALARIDET,WINDLEJJ,WHYTEDB,etal.ImmortaliGzationofpituitarycellsatdiscretestagesofdevelopmentbydiGrectedoncogenesisintransgenicmiceJ.Development,1996,12210:3319G3329. 3刘希民,葛林阜,吕军.丙氧鸟苷应用机会与分离GVHD和GVL效应关系J.青岛大学医
12、学院学报,2005,414:283G285. 4SMEEDF,BOEHMER,CHERNOW M,etal.Intracellularmetabolism and enzymatic phosphorylation of 9G1,3GdiGhydroxyG2Gpropoxymethylguanine andacyclovirin herpessimplexvirusGinfectedanduninfectedcellsJ.BiochemicalPharmacology,1985,347:1049G1056. 5MATTHEWST,BOEHMER.Antiviralactivityandmech
13、aGnismofactionofganciclovirJ.ReviewsofInfectiousDiseaGses,1988,103:S490GS494. 6WIEWRODTR,AMIN K,KIEFER M,etal.AdenovirusmediatedgenetransferofenhancedherpessimplexvirusthyGmidinekinasemutantsimprovesprodrugmediatedtumorcellkillingJ.CancerGeneTherapy,2003,105:353G364. 7马驰原,卢亦成,任常春,等.垂体生长激素腺瘤靶向性基因治疗系统的构建及实验研究J.中华神经外科疾病研究杂志,2005,45:391G394. 8柳湘,韩俊松,田培坤.新型基因转移系统介导p21基因治疗人脑胶质瘤的体外研究J.中国肿瘤生物治疗杂志,2000,71：11G14. 9侯建全,温端改,潘浩,等.单纯疱疹病毒胸苷激酶基因和更昔洛韦对膀胱癌细胞的旁观杀伤效应J.中华实验外科杂志,2002,196:501G502.