《HSA与脂肪酸的关系研究中T2W-RD-Water LOGSY技术的运用,生物化学论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HSA与脂肪酸的关系研究中T2W-RD-Water LOGSY技术的运用,生物化学论文.docx（16页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、HSA与脂肪酸的关系研究中T2W-RD-Water LOGSY技术的运用,生物化学论文摘 要： 脂肪酸在哺乳动物的能量代谢中发挥着至关重要的作用, 同时也是合成细胞膜磷脂和其他生物活性化合物的重要物质.脂肪酸在血液中的溶解度很低, 主要以与蛋白质结合状态存在, 白蛋白是游离脂肪酸的主要运输者和储存者.因而, 研究脂肪酸和白蛋白的互相作用具有非常重要的医学和生物学意义.本文主要利用基于核磁共振 (NMR) 的组氨酸选择性检测技术T2W-RD-Water LOGSY研究天然同位素丰度人血清白蛋白 (HSA) 与脂肪酸的互相作用, 结果发现脂肪酸结合前后, HSA的特征组氨酸谱图变化明显, 部分组氨
2、酸信号的相对强度随脂肪酸浓度的增加而不断减小, 相应的滴定曲线分析表示清楚HSA外表有两个强的脂肪酸结合位点.除此之外, 部分谱线的化学位移变化讲明HSA和脂肪酸的强结合还会引发HSA相应的构象变化.本文本文关键词语语： 核磁共振 (NMR) ; T2W-RD-Water LOGSY; 人血清白蛋白 (HSA) ; 脂肪酸; 组氨酸;Abstract： Fatty acids are important substrates for the synthesis of membrane phospholipids and other bioactive compounds, and thus p
3、lay vital roles in mammalian energy metabolism. Fatty acids often bind to proteins in the blood. Albumin is a major carrier and depot of free fatty acids. In this paper, the interactions between human serum albumin (HSA) and fatty acids were studied using nuclear magnetic resonance (NMR) -based hist
4、idine selective detection technology T2W-RD-Water LOGSY. The spectra of HSA before and after fatty acids binding were compared. It was found that signals of the characterized His in HSA changed significantly with the addition of fatty acids. Two high-affinity binding sites between the HSA and fatty
5、acids were identified from the titration curve. It was also demonstrated that binding to fatty acids could induce conformation changes for HSA.Keyword： nuclear magnetic resonance (NMR) ; T2W-RD-Water LOGSY; human serum albumin (HSA) ; fatty acid; histidine;0、引言脊椎动物体内含有非常丰富的白蛋白, 而人血清白蛋白 (Human Serum
6、Albumin, HSA) 在人体血清中含量高达血清蛋白总量的60%65%, 其主要作用是调节浸透压.功能上, 白蛋白作为转运蛋白能够广泛运载和短暂存储各种内源性与外源性的化合物, 例如转运脂肪酸、影响多种药物的代谢动力学、清理有毒代谢物、提高血清抗氧化能力等1.早在1941年, Kendall等人2就初次发现HSA结合脂肪酸 (Fatty Acid, FA) 的现象, 当时提出 血清中某些染料使白蛋白重结晶4次之后仍然呈现黄色, 怀疑这些染料本质上可能是类脂 .随后的几十年中, 随着科学技术的进步, 不断有研究进一步揭示白蛋白结合脂肪酸的能力.晶体构造显示3, 白蛋白外表以非对称的形式分布着
7、7个当量的中长链脂肪酸结合位点, 并有着不同的结合强度, 表示清楚白蛋白与脂肪酸的作用形式复杂多样.在正常的人生理条件下, 每摩尔HSA大约能够结合0.12.0 mol脂肪酸4.当下, 人们对脂肪酸的摄取主要是饱和脂肪酸, 越来越多的研究表示清楚, 脂肪酸与很多疾病, 包括癌症的产生都有着密切关系, 且游离脂肪酸对机体脂代谢的反响比甘油三酯和胆固醇更为灵敏, 一些重要游离脂肪酸含量的异常变化是病情发展的重要根据.然而由于游离脂肪酸的水溶性极差, 通常需要结合血清白蛋白进行储存和运输, 因而对人体血液中白蛋白与脂肪酸的互相作用研究具有非常重要的意义.研究表示清楚, 在蛋白质与配体的互相作用中,
8、组氨酸 (Histidine, His) 是常见的活性中心, 具有重要的功能, 并发挥着不可替代的作用.这主要得益于其独特的分子构造, 组氨酸有一个咪唑侧链, 咪唑环侧链的p Ka约为6.0, 使得组氨酸的p Ka相对中性, 这就意味着在细胞中很小的p H变化都会引起组氨酸的电荷变化5.正由于如此, 组氨酸在各种蛋白中常作为配体结合位点, 同时也作为酶催化的活性中心, 例如促胰凝素的催化功能6.从本质上讲, 咪唑侧链上有两个性质不同的氮原子, 华而不实一个结合氢原子呈弱酸性, 另一个含孤电子对呈碱性, 因而组氨酸既能够作为酸提供质子, 又能够作为碱接受质子, 还能够同时作为氢键供体和氢键受体.
9、在生理条件下, 组氨酸同时以3种不同的状态存在:一种质子化状态, 两种不同的中性互变异构体状态, 多样化的存在形式使组氨酸能够作为亲核试剂、酸碱催化剂、质子梭子等, 因而可作为研究蛋白质动态构造和蛋白配体互相作用的一个理想探针.在构成白蛋白的585个氨基酸中, 共有16个组氨酸, 华而不实5个位于构造域外表, 分别为domain I的His67、His146和domain II的His242、His247、His2887.这些组氨酸不仅牵涉白蛋白的构象变化, 而且介入锌离子、脂肪酸等配体的互相作用7-9 (如此图1所示) .不同物种血清白蛋白的序列比对显示组氨酸位点和数目都高度保守, 这更进一
10、步讲明了组氨酸在白蛋白生物活性中扮演重要的角色.因而, 研究蛋白质外表组氨酸与配体的互相作用对于我们了解白蛋白结合脂肪酸的作用机制至关重要.近些年来, 除了晶体衍射, 液体核磁共振 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 技术在白蛋白多结合位点研究中应用广泛10,11.有人通过使用13C标记的长链脂肪酸, 采用1D 13C NMR12和2D1H-13C HSQC13等方式方法观测小分子以表征不同脂肪酸与白蛋白的结合位点及结合强度.然而, 对于白蛋白这样分子量较大的天然同位素丰度蛋白质, 常规手段仍然很难直接对其进行观察.一些用于研究配体与蛋白之间的互相作用的技术,
11、如Water LOGSY14 (Water-Ligand Observed via Gradient Spectroscop Y) , STD (Saturation Transfer Difference) 技术等, 直接观测介入互相作用的小分子, 能够很容易区分出小分子能否能够结合靶标大分子, 因而在高通量药物挑选方向应用非常广泛15, 但是此类方式方法难以获得关于大分子的作用信息, 如结合位点等.本课题组前期研究中, 在Water LOGSY的基础上, 使用水的辐射阻尼 (Radiation Damping, RD) 效应取代选择性脉冲或组合脉冲来完成对水磁化矢量的选择性激发, 降低由此
12、产生的弛豫效应、扩散效应和饱和效应, 以提高Water LOGSY实验的灵敏度16.对于单一大分子体系, 同时结合横向弛豫加权 (T2 Weighted, T2W) 技术, 通过调节自旋回波的时间来滤掉蛋白主链宽包信号, 进而保存蛋白分子外表与溶剂分子有快交换或强核Overhauser效应 (Nuclear Overhauser Effect, NOE) 的信号, 进而获得蛋白质外表组氨酸的信号, 并通过观测其化学位移等随配体浓度的变化, 获得互相作用信息.这些工作表示清楚T2W-RD-Water LOGSY技术能够大大简化HSA 1D 1H NMR谱, 且低场区域信号大部分来自于白蛋白构造域
13、外表的组氨酸17.本文在上述工作基础上, 对检测到的HSA外表组氨酸信号进行了部分归属, 并将T2W-RD-Water LOGSY技术应用于HSA与脂肪酸的互相作用研究.1、 实验部分1.1、 实验试剂HSA固体粉末 (去脂肪酸, 纯度 98%) 、无水磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 、二水合磷酸二氢钠 (Na H2PO4 2H2O) 、二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT) 、十六碳饱和脂肪酸 (C16:0) 、二甲亚砜 (Dimethylsulphoxide, DMSO) 和重水 (D2O) 均购于Sigma-Aldrich公司.1.2、 样品配制脂肪酸储液制备:使用分析天
14、平准确称量25.6 mg脂肪酸 (C16:0) 粉末溶于500 L DMSO中, 得到200 mmol/L的脂肪酸储液, 放入4冰箱存储备用.HSA-FA复合物制备:配制终浓度为0.5 mmol/L的HSA于100 mmol/L且p H为7.40的PBS缓冲溶液中, 并与脂肪酸储液一同放入37恒温水浴锅中温浴5 min, 随后在500mL HSA样品中分别滴加不同量脂肪酸储液使其最终与HSA的比例 (FA:HSA) 为0:1、0.4:1、0.8:1、1.2:1、1.6:1、2.0:1、2.4:1和2.8:1, 补加DMSO使其终量均为5 L以消除DMSO可能对HSA产生的影响, 低频超声后放入
15、37恒温水浴锅孵化2 h.将所有样品装入直径为5 mm的NMR样品管中, 实验前置于4冰箱待用.1.3、 NMR实验所有实验均在Bruker Avance850型NMR谱仪上采集, 对应质子共振频率为850.3 MHz, 实验温度为298 K.T2W-RD-Water LOGSY实验在采样之前采用WATERGATE W5序列抑制水峰, T2W采用CPMG脉冲序列, CPMG总的自旋回波时间为62 ms, 极化转移的混合时间为800 ms, W5脉冲串的时间间隔为60 s, 辐射阻尼效应调控延迟时间 ( ) 为22 ms, 等待时间为1 s, 采样点数为64 k, 累加次数为512, 谱宽为10
16、 204.08 Hz.2D 1H-1H TOCSY实验的间接维采样形式为States-TPPI, 两维谱宽均为8 503.40 Hz, 采样数据点阵t2 t1=2 048 256, 累加次数为32, 所有实验的中心频率均为3 987.92 Hz.1.4、 实验数据处理实验数据处理均使用Bruker Topspin V3.2软件完成 (Bruker Biospin, Germany) , 1D自由感应衰减 (Free Induction Decay, FID) 信号在进行傅里叶变换之前采用指数窗函数进行处理, 线宽因子为1 Hz.2、 结果与讨论2.1、 HSA外表部分组氨酸的信号归属由于质子灵
17、敏度非常高, 且天然丰度同位素含量丰富, 因而1H NMR在各种有机大小分子的构造及动力学研究上应用非常广泛.然而对于分子量较大的蛋白质例如HSA (分子量为66.5 k) , 由于各个信号之间重叠严重, 谱峰变宽, 普通1D 1H NMR谱很难得到有用的信息.而T2W-RD-Water LOGSY技术能够大大简化分子量较大的蛋白质的1D 1H NMR谱, 获得天然丰度蛋白质外表的组氨酸信号.位于HSA构造域外表的5个组氨酸不仅牵涉白蛋白的构象变化, 而且介入锌离子、脂肪酸等配体的互相作用.因而通过选择性检测这些蛋白外表的组氨酸能够简化谱图, 进而对蛋白与配体的互相作用进行研究表征.分子量较大
18、的蛋白质的横向弛豫时间 (T2) 较短, 2D TOCSY谱适用于检测大分子量的蛋白质中构象灵敏多变的区域, 尤其是活泼的氨基酸侧链.组氨酸咪唑环上的Hd2和He1组成特征自旋相关网络 (如此图2所示) , 这两个氢核在1H-1H TOCSY谱图中表现为一组处于NMR谱低场区的穿插耦合信号.我们采集了HSA的2D TOCSY谱图, 并将其低场区域的信号与1D T2W-RD-Water LOGSY NMR谱图进行比对, 结果如此图3所示.从图3能够看到, 1D 1H NMR谱中每个峰 (H1H5) 在二维谱中都有相对应的穿插峰.本课题组曾经运用T2W-RD-Water LOGSY方式方法对HSA
19、做过正常血清p H 7.357.45范围滴定和锌离子滴定实验17,18.结果显示当p H逐步升高时, 除了d7.7处峰无任何变化外, 其他峰的化学位移均向高场发生不同程度的移动.而锌离子滴定实验结果则显示, 随着锌离子的不断滴加, H4/H5峰强度逐步减小至消失.结合组氨酸特性及我们的TOCSY图谱, 不难得出H1H5即为白蛋白构造域外表的五个组氨酸His67、His146、His242、His247和His288.华而不实His67/His247由于介入锌离子的配位, 当锌离子结合时, N-H交换受限制, 信号消失, 因而我们推断H4/H5是来自锌离子结合位点的His67/His247两个残
20、基.图2 组氨酸示意图Fig.2 The diagram of Histidine图3 HSA的1H-1H TOCSY谱图.图中H表示组氨酸, HN (N=15) 表示同一个组氨酸咪唑环上两个质子 (图2中的He1与Hd2) 的穿插峰Fig.3 1H-1H TOCSY spectrum of HSA.H represents His, HN (N=15) represents the cross peak between He1 and Hd2 showed in Fig.22.2、 HSA与脂肪酸互相作用的研究正常成年人血清中十六烷酸 (C16:0) 和十八烷酸 (C18:0) 含量最高,
21、我们选用C16:0为代表, 对HSA与游离脂肪酸的结合进行研究, 使用T2W-RD-Water LOGSY技术对HSA进行了脂肪酸滴定实验, 结果如此图4所示.晶体构造表示清楚HSA外表以非对称的形式分布着7个亲和力不同的脂肪酸结合位点, 华而不实结合位点FA1和FA7分别牵涉到两个组氨酸His146和His242的介入7,19.根据Water LOGSY的机制, 当脂肪酸逐步占据HSA中结合位点的疏水腔, 组氨酸侧链质子与周围水分子的交换会遭到影响, 在谱图上反映为信号强度的降低.由图4 (a) 能够看到, 随着脂肪酸比例的增加, 5个组氨酸残基中, H1化学位移和强度均未发生变化, H2和
22、H3的强度逐步降低, 经TOCSY确认, H4和H5的化学位移从d6.63移至d6.79, 向低场方向发生了非常明显的位移.因而我们推断信号强度受脂肪酸结合影响的H2/H3很可能是来自His 146或His 242.我们进一步选择低场H1的信号强度作为参照IR, 选择峰形相对清楚明晰独立的H3图4 (a) 中*位置的信号强度与其比照得到相对峰强 (I/IR) , 并对该相对峰强的变化与FA:HSA比例做了拟合曲线.从图4 (b) 能够看出, 在脂肪酸含量相对较少的时候, 该峰强度稍有降低;随着脂肪酸比例的不断增加, 在FA:HSA超过1:1时, 峰强度变化比拟明显;当比例超过2:1时, 峰强度
23、变化再次趋于平缓.表示清楚HSA有2个高亲和的脂肪酸结合位点优先结合脂肪酸, 当脂肪酸添加比例到达2:1时, 该位点对脂肪酸的结合趋于饱和, 在其饱和后, 才可能有其他结合位点与脂肪酸进一步发生互相作用.上述结果与Wosilait等人20通过理论分析结果基本相符.Wosilait等人模拟发现, 当FA:HSA的生理浓度范围在0.5:11:1时, 绝大多数脂肪酸是结合在高亲和结合位点, 随着脂肪酸含量的增加会有部分脂肪酸分布到稍弱的结合位点.华而不实结合优先次序的差异可能是由于HSA的酸碱浓度以及构象变化不同而引起的.除此之外, 通过读取目的峰的相对强度值并对应滴定曲线, 我们能够大致判定脂肪酸
24、与HSA的结合比例, 进而推断游离脂肪酸的含量, 为一些疾病的诊断提供参考根据.图4 脂肪酸滴定HSA的 (a) T2W-RD-Water LOGSY谱及 (b) 其对应的特征谱线 (*) 相对强度随FA:HSA浓度比变化曲线Fig.4 T2W-RD-Water LOGSY spectra of fatty acid titrated HSA (a) and peak intensity of the characterized His (*) versus FA:HSA concentration ratio (b)除了峰强度的变化, 从图4 (a) 中我们可以以看到随着脂肪酸含量的滴加,
25、表征锌离子结合位点的His67和His24718信号化学位移往低场方向发生了很明显的位移.这是由于FA1和FA7处于白蛋白构造域I和构造域II之间, 同时又与锌离子结合位点和药物结合位点I邻近, 因而这块区域的构象变化非常灵敏, 脂肪酸的结合可能引起了白蛋白的构象变化, 间接影响了锌离子结合位点化学环境的变化, 导致化学位移的变化.晶体构造同样也表示清楚当脂肪酸结合在HSA之后, 蛋白分子的不同构造域之间发生明显转动, 除此之外脂肪酸的结合还导致一些氨基酸疏水侧链发生移动, 进而开放了一些以前被这些氨基酸疏水侧链禁锢的结合位点21.3、 结论我们将组氨酸选择性检测技术T2W-RD-Water
26、LOGSY技术应用于研究HSA与脂肪酸的互相作用, 该技术能够检测HSA构造域外表比拟活泼的5个组氨酸, 华而不实位于FA1和FA7结合位点的His146/His242能够用来表征HSA对脂肪酸的结合.通过脂肪酸滴定前后谱图的变化我们发现脂肪酸优先进入亲和力高的结合位点, 当脂肪酸结合比例到达2.0时, 该位点对脂肪酸的结合趋于饱和, 表示清楚HSA外表有两个高亲和力的脂肪酸结合位点.同时, 我们能够参考该曲线判定未知样品中HSA结合脂肪酸的比例, 进而有助于测定血清中脂肪酸的相对含量.以下为以下为参考文献：1SLEEP D.Albumin and its application in dru
27、g deliveryJ.Expert Opin Drug Deliv, 2021, 12 (5) :793-812.2KENDALL F E.Studies on human serum proteinsJ.J Biol Chem, 1941, 138 (1) :97-109.3SUGIO S, KASHIMA A, MOCHIZUKI S, et al.Crystal structure of human serum albumin at 2.5?resolutionJ.Protein Eng Des Sel, 1999, 12 (6) :439-446.4FREDRICKSON D S,
28、JR R S G.The metabolism of albumin-bound C14-labeled unesterified fatty acids in normal human subjectsJ.J Clin Invest, 1958, 37 (11) :1504-1515.5LIAO S M, DU Q S, MENG J Z, et al.The multiple roles of histidine in protein interactionsJ.Chem Cent J, 2020, 7 (1) :44.6SCHNEIDER F.Histidine in enzyme ac
29、tive centersJ.Angew Chem Int Ed Engl, 1978, 17 (8) :583-592.7BLINDAUER C A, HARVEY I, BUNYAN K E, et al.Structure, properties, and engineering of the major zinc binding site on human albuminJ.J Biol Chem, 2018, 284 (34) :23116-23124.8KANEKO K, CHUANG V T, MINOMO A, et al.Histidine146 of human serum
30、albumin plays a prominent role at the interface of subdomains IA and IIA in allosteric ligand bindingJ.IUBMB Life, 2018, 63 (4) :277-285.9BHATTACHARYA A A, GR NE T, CURRY S.Crystallographic analysis reveals common modes of binding of medium and long-chain fatty acids to human serum albuminJ.J Mol Bi
31、ol, 2000, 303 (5) :721-732.10DAI C Y, ZHANG Z T, LIU M L, et al.Application of NMR in the studies of structure and interactions of -synucleinJ.Chinese J Magn Reson, 2021, 33 (1) :153-167.戴晨晔, 张则婷, 刘买利, 等.NMR在 -Synuclein的构造及互相作用研究中的应用J.波谱学杂志, 2021, 33 (1) :153-167.11CHENG K, YAO C D, XU G H, et al.In
32、teraction of GB1 with metal ions studied by NMR spectroscopyJ.Chinese J Magn Reson, 2021, 35 (1) :1-7.成凯, 姚陈叠, 徐国华, 等.GB1与金属离子互相作用的NMR研究J.波谱学杂志, 2021, 35 (1) :1-7.12SIMARD J R, ZUNSZAIN P A, HAMILTON J A, et al.Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin reveale
33、d by NMR drug-competition analysisJ.J Mol Biol, 2006, 361 (2) :336-351.13HAMILTON J A.NMR reveals molecular interactions and dynamics of fatty acid binding to albuminJ.Biochim Biophys Acta, 2020, 1830 (12) :5418-5426.14DALVIT C, PEVARELLO P, TAT?M, et al.Identification of compounds with binding affi
34、nity to proteins via magnetization transfer from bulk waterJ.J Biomol NMR, 2000, 18 (1) :65-68.、15DALVIT C, FOGLIATTO G, STEWART A, et al.Water LOGSY as a method for primary NMR screening:practical aspects and range of applicabilityJ.J Biomol NMR, 2001, 21 (4) :349-359.16SUN P, JIANG X W, JIANG B, e
35、t al.Biomolecular ligands screening using radiation damping difference Water LOGSY spectroscopyJ.J Biomol NMR, 2020, 56 (3) :285-290.17CHEN Y, SUN P, LIU M L, et al.Effects of metal ions on human serum albumin studied by radiation damping water-ligand observed via gradient spectroscopyJ.Chinese J Ma
36、gn Reson, 2021, 34 (3) :266-274.陈瑶, 孙鹏, 刘买利, 等.离子对人血清白蛋白影响的1H NMR研究J.波谱学杂志, 2021, 34 (3) :266-274.18陈瑶.人血清白蛋白与配体之间互相作用的核磁共振研究D.武汉:中国科学院武汉物理与数学研究所, 2021.19FANALI G, DI MASI A, TREZZA V, et al.Human serum albumin:from bench to bedsideJ.Mol Aspects Med, 2020, 33 (3) :209-290.20WOSILAIT W D, SOLER-ARGILAGA C.A theoretical analysis of the multiple binding of palmitate by bovine serum albumin:The relationship to uptake of free fatty acids by tissuesJ.Life Sci, 1975, 17 (1) :159-166.21VAN DER VUSSE G J.Albumin as fatty acid transporterJ.Drug Metab Pharmacokinet, 2018, 24 (4) :300-307.