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1、肌球蛋白轻链的磷酸化研究综述,生物化学论文肌球蛋白主要存在于平滑肌中， 它是肌原纤维粗丝的组成单位。 其分子形状如豆芽状，由多条重链与多条轻链组成。 肌球蛋白的家族较大，当前发现的肌球蛋白有 24 种，但根据其来源又可分为传统的肌球蛋白和非传统的肌球蛋白，如传统的肌球蛋白为肌肉的肌球蛋白，即肌球蛋白，但非肌肉细胞也存在肌球蛋白， 为非肌肉肌球蛋白； 非传统的肌球蛋白是指肌肉中不含有的肌球蛋白，如肌球蛋白、，只存在于非肌肉细胞中；肌球蛋白、和只存在于植物当中。除此之外，肌球蛋白在生物体内的作用是细胞运动，胞引作用和泡液收缩；骨骼肌肌球蛋白的作用是使骨骼肌肌肉收缩； 肌球蛋白主要功能是靶向小包运输
2、和 mRNA 的靶向运输1. 在生物有机界中，利用化学能/化学势能进行机械做功的生物大分子，称为分子马达。 而肌球蛋白作为一种分子马达2,介入了肌肉收缩、趋化性胞质分裂、胞引作用、膜泡运输以及信号传导等活动1. 当前研究得较多的是肌球蛋白， 其最早发现于动物细胞的肌肉组织和细胞质中， 形状如 Y 型，是一个六聚体的大分子蛋白质，包括两条相对分子质量约为 220 kD 的重链、两条约 17 kD的必须轻链和两条约 20 kD 的调节性轻链3 . 根据重链在细胞内所起的作用， 根据构造和功能不同可划分为 3 个区域：1位于重链的 N 末端构成一个球状的头部，含有一个肌动蛋白 actin 结合位点和
3、 ATP 结合位点的催化区域，负责释放化学能；2重链的 C 末端则构成一个细长的 -螺旋状的尾部， 尾部构造域含有决定尾部是同膜结合还是同其他的尾部结合的位点；3连接头尾的是 -螺旋状的颈部，其与必须轻链、调钙素或类似钙调素的调节轻链相连， 颈部是起到水平臂作用的区域， 在这个区域中通过 ATP 水解将产生动力冲程，实现将化学能转化为机械能4. 通过对各个物种的肌球蛋白重链， 轻链序列的功能构造域分别进行氨基酸水平上的多序列比对，结果发现肌球蛋白较为保守，只是个别氨基酸序列存在差异， 这表示清楚各个物种肌球蛋白磷酸化的作用机制与功能大体一致 图 1。 2 肌球蛋白轻链的磷酸化由肌动蛋白-肌球蛋
4、白actin-myosin互相作用介导的细胞收缩，对肌肉与非肌肉细胞的一些生理活动起着至关重要的作用，包括细胞分裂、粘连、趋化性和胞质分裂5,其动力学活性会调控细胞收缩，调节血管浸透性，控制平滑肌细胞中的血压6. 2.1 肌球蛋白轻链磷酸化的作用机制。 肌球蛋白 平滑肌与非肌肉蛋白受肌球蛋白轻链 MLC磷酸化调控7.磷酸化的肌球蛋白是维持细胞骨架活性及细胞功能的重要效应因子8, 9. 肌球蛋白轻链激酶myosin light chain kinase, ML-CK 和 ROCK/ROK/Rho 激 酶 Rho kinase, ROCK是在体内和体外使 MLC 磷酸化的两种重要激酶10. 通常以
5、为， 当 Ca2+与钙调蛋白复合体Calmodulincomplexes,CaM结合后，会激活 MLCK,进而 ML-CK 使 肌 球 蛋 白 轻 链 20 myosin light chain 20,MLC20上第 19 位的丝氨酸 Ser19磷酸化，导致激活肌球蛋白头部的 Mg2+-ATP 酶简称 ATP 酶11,该酶水解 ATP 产生能量会使其构象发生转变，这种构象会使肌球蛋白去结合肌动蛋白 actin，利用ATP 构成一种细胞收缩的压力12. 相反地，用肌球蛋白轻链磷酸酶 myosin light chain phosphatase,MLCP 使 MLC 去磷酸化后会使构象弯曲，结合肌
6、动蛋白的能力下降。 MLCP 是一个异源三聚体蛋白，由磷酸酶 PP1C、肌动蛋白结合区和调节区域 MYPT 以及一个 20 kD 的小亚基 ML20 组成，但 ML20 的功能尚不清楚。MLC 的这种周期性的磷酸化与去磷酸化的状态， 是细胞发生运动和收缩的必备条件13. RhoA 的 效应分子 ROCK14是肌球蛋白磷酸化和调节肌球蛋白功能的另一个重要调节因子，它使肌球蛋白结合肌球蛋白磷酸酶 MLCP的位点MBS磷酸化15,抑 制 MLCP 活 性 ,进而增加了肌球蛋白的磷酸化水平， 诱导 RhoA 介导的应力纤维和粘着斑装配。在平滑肌和非肌细胞中，ROCK还能直接磷酸化 MLC 刺激肌球蛋白
7、收缩16. 对于所有的肌球蛋白， 大体机制都能够解释为当肌动蛋白结合到马达区域时， 马达运动由于在活性位点 ATP 诱导的构象发生变化引起 RD 一种调控区域能够使必须轻链、调节轻链以及重链结合旋转17. RD 包含着重链 heavy chain,HC的一段较长的螺旋， 能够使调节轻链 regualatelight chain,RLC 和 必须轻链 essential light chain,ELC 以反向平行的方式结合。 轻链能够稳定 HC螺旋，然后作为一个较为自由的转换器，由一种构象转换为另一种构象去产生工作的动力。 2.2 肌球蛋白轻链磷酸化的主要生物学功能 2.2.1 磷酸化对细胞迁移
8、的调节 Totsukawa 等在 2004 年将成纤维细胞作为研究材料发现，MLCK 与 ROCK 在调节 MLC 磷酸化时，在 MLC 所处的不同空间分布中起着不同的作用。 在细胞迁移中 MLCK 诱导细胞周边和前端肌球蛋白轻链磷酸化，ROCK 诱导细胞中心肌球蛋白轻链磷酸化。 肌球蛋白在细胞周边的磷酸化有两种功能：第一，阻止由肌动蛋白多聚化产生的突触，以便于细胞迁移；第二，位于细胞周边的肌球蛋白磷酸化对在运动细胞的前端装配成熟的粘附构造是必需的16. 2.2.2 磷酸化对细胞收缩行为的影响 肌球蛋白产生的收缩力不仅为细胞的迁移提供动力，在维持细胞形态，促进伤口愈合，介导胞外基质和细胞信号转
9、导中也起着重要的作用16.Beningo 等使用特异性抑制剂 blebbistain 处理后，发现抑制了肌球蛋白的收缩活动， 同时抑制ROCK 也会很大程度减少肌球蛋白的收缩18. 2.2.3 磷酸化对细胞形态与凋亡的影响 肌球蛋白的活性对于应力纤维粘着斑的构成是必需的。 ROCK 使肌球蛋白结合肌球蛋白磷酸酶 MLCP的位点MBS磷酸化，抑制肌球蛋白磷酸酶活性，进而增加了肌球蛋白的磷酸化水平，诱导 RhoA 介导的应力纤维和粘着斑装配。 而且它还与整合素介导的一些信号通路相关16 表 1 .p114RhoGEF 是一种 RhoA 激活剂，能结合到肌球蛋白 IIA 上，并起到一定的调控作用19
10、, 20,有数据显示，p114RhoGEF 能驱动上皮细胞的迁移，变形虫的运动以及肿瘤细胞的入侵21. 2.3 肌球蛋白轻链磷酸化的最新研究成果 2.3.1 -抑制蛋白调控的磷酸化 2020 年 Elie Simard 等通过利用兔子的骨骼肌，发现 -抑制蛋白能够调控由血管紧张肽型1a 受体AT1aR刺激的肌球蛋白 MLC 的磷酸化。 -抑制蛋白属于抑制蛋白家族， 包括 -抑 制蛋白-1 和 -抑制蛋白-2, 它能够在哺乳动物组织中广泛表示出5. -抑制蛋白介导 G 蛋白耦联受体和其他一些受体的信号通路的调控， 在细胞的生长、凋亡及免疫功能中都发挥了重要作用，并且与一些疾病的发病密切相关。 一
11、些研究表示清楚， -抑制蛋白-1 对于激活 RhoA/ROCK 以及迫使构成肌纤 维 是 不 可 缺 失 的 . 一 些 G 蛋 白 偶 联 受 体 GPCRs，如血管紧张肽型 1a 受体 AT1aR，介入调控细胞收缩12.而 AT1aR 的拮抗剂 Ang能够很好地防治血管收缩类的疾病22. 另外，ElieSimard 等利用酵母双杂交系统研究发现，由于 -抑制蛋白-1 的 163-253 位氨基酸包含 MYPT-1的结合区域，所以 -抑制蛋白-1 1-418 位氨基酸和 1-253 位氨基酸会与 MYPT-1 的 643-943 位氨基酸互相作用。 当遭到 AT1aR 的刺激时， -抑制蛋白
12、-2 也会与 MYPT-1 肌球蛋白调控区域相结合。 通过 -抑制蛋白诱导会激活 AT1aR 的信号通路，促进 MLC 的磷酸化，而 -抑制蛋白-2/MYPT-1 复 合体会阻断到 MLCP 亚 基的入口 ,亲和性降低，所以 -抑制蛋白-2 会使 MLC 去磷酸化。 周期性的 MLC 磷酸化会加速细胞收缩23. 此研究表示清楚， -抑制蛋白对于 MLC 的磷酸化与去磷酸化是不可缺失的，当肌肉细胞中缺失 -抑制蛋白-1,在应对 AT1aR 的刺激下，MLC 的磷酸化水平会下降。经实验发现，这可能是基于两方面的原因： 其一是 MYPT-1 远离了 MLCP 的复合体；其二是依靠 -抑制蛋白-1 的
13、 RhoA 因子水平下降24,随后 ROCK 活性损失 ,MLCP 活性加强 ; 但当肌肉细胞中缺失 -抑制蛋白-2, 在 AT1aR 的拮抗剂 Agonist 的刺激下， 会使 MLC 磷酸化水平升高。 有趣的是，两种 -抑制蛋白会互相调控 MLC的磷酸化，缺失 -抑制蛋白-1 或者 -抑制蛋白-2 对 细胞收缩和运动都会有类似的效果 . 因而 ,MLC 的 磷酸化对细胞收缩和驱动细胞运动起着关键性作用 图 2。 2.3.2 ELC 与 RLC 互相作用对磷酸化的影响 上文提到，肌球蛋白由重链与轻链组成，而轻链又是由必须轻链 ELC与调节轻链 RLC构成。对于所有的肌肉组织， 收缩与释放都是
14、由细胞内的 Ca2+含量变化调控的。 在横纹肌中，Ca2+结合到细肌丝的肌钙蛋白的复合体上激活肌动蛋白-肌球蛋白 actin-myosinATP 酶，因此发生肌肉收缩。 相比拟而言， 在软体动物与脊椎动物的平滑肌和非肌肉细胞中， 收缩的方式有两种： 其一直接由Ca2+结合到肌球蛋白ELC2上；其二是由 RLC 的N-端区域磷酸化，这种磷酸化由 Ca2+依靠的 ML-CK 调控的。 肌球蛋白调控的构造机制初次以原子级的分辨力揭示，扇贝肌球蛋白的 RD 构造包含着 ELC和 RLC,以及能够结合一部分轻链的 HC25, 26. 在扇贝肌球蛋白中，Ca2+会结合到 ELC-N 端构造域中的 EF 臂
15、的上。 2020 年 Shaowei Ni 等通过用鸡的平滑肌 HMM 在 Sf9 细胞中表示出后得到 HC、RLC 与 ELC 的全长。 研究发现，必须轻链 ELC与调节轻链 RLC交界处的修饰会阻断激活平滑肌肌球蛋白依靠的磷酸化。他们表示出了 16 个平滑肌水解重酶解肌球蛋白 SmHMM，两条 MLC 与周围的 HC 的衔接处发生突变。 结果发现：1RLC被 MLCK 磷酸化；2 亚基组成是正常的，突变并不会降低 ELC 或者 RLC 结合到 HC 的能力；3依靠肌动蛋白激活的 ATPase 的动力学以及在体外运动的 机 械 性 能 在 去 磷 酸 化 的 状 态 下 与 WTHMM 相一
16、致；4 对于磷酸化的水解重酶解肌球蛋白 HMM，缺失肌动蛋白 actin状态下其 ATPase活性会被抑制。 另外，当阻断 RLC 与 ELC 的互相作用时， 磷酸化不再有激活 HMM 捕捉肌动蛋白的能力。 经研究发现，这种现象与 RLC 的 M129Q与 G130C 的突变有关。 M129Q 和 G130C 对于稳定构造，激活捕捉 actin 的能力起着关键作用。 同时研究发现， 与 Asp-131 互相作用的 HC 突变体Q826A,也 能够起稳定 RLC/ELC 的 互相作用 图3 . 通过突变 HC、RLC 以及 ELC 去毁坏三者之间的互相作用，若不发生磷酸化，所有的突变体都与野生型
17、 wt的现象类似，相反，肌球蛋白会运动缓慢，ATPase 活性下降。 分子动力学研究表示清楚，阻断RLC/ELC 的互相作用会导致肌球蛋白弹性增加，很可能会阻碍磷酸化的激活。 因而作者猜测，RLC磷酸化重要的功能就是去维持 RLC 与 ELC 互相作用的完好性。 一旦 RLC/ELC 互相作用阻断，构造毁坏，就不会再遭到磷酸化的调控的影响27. 3 肌球蛋白重链的磷酸化 非肌肉肌球蛋白是一个六聚体复合物，由两条重链 NMHC-、两条必须轻链、两条调节轻链组成。 在脊椎动物中，NMHC-有 3 种异构体，分别是 NMHC-AMYH9、NMHC-BMYH10以及 NMHC-CMYH1428,在组织
18、和细胞形态中都会表现出不同的形式29. 固然 NMHC-的异构体会有很高的保守性， 但是一些酶的活性还是有些差异的30. 另外，NMHC-在细胞中的定位也不一样31,也会与不同的蛋白结合32. 3.1 重链磷酸化的作用机制 在哺乳动物细胞中， 肌球蛋白调节轻链的丝氨酸 19 Ser-19的磷酸化普遍地介入了体内装配的调控33,但是，存在一种证据证明非肌肉肌球蛋白装配的调控是能够通过重链的磷酸化来实现的，十分是蛋白激酶 C PKC 与酪蛋白激酶2 CK2对肌球蛋白-A 与-B 有着至关重要的作用，PKC 会使 NMHC-A 的 Ser1916 磷酸化34. 通过 PKC 或者 CK2 使重链磷酸
19、化会减少肌球蛋白异构体装配成肌丝35. 牵涉到磷酸化作用，肌球蛋白-A 装配能够通过结合转移因子 mts1 或者钙结合蛋白 S100A4 来调控36. S100A4 会优先地结合到非肌肉肌球蛋白-A37,然后促进单体的、 未装配的肌球蛋白-A 装配38. CK2 使NMHC-A 的 Ser1943 磷酸化会抑制钙结合蛋白S100A4 结合以及 S100A4 诱导的单纤维的装配，S100A4 介 导的肌球蛋白 -A 肌 纤维的去磷酸化39. 因而，重链的磷酸化以及 Ca2+的结合会调控S100A4 与肌球蛋白-A 的互相作用。 3.2 肌球蛋白重链磷酸化的生物学功能及最新研究成果 3.2.1 重
20、链磷酸化对癌细胞迁移的调控 2007 年 Natalya G. Dulyaninova 等研究发现，肌球蛋白-A 重链磷酸化能够调控 MDA-MB-231 癌细胞的迁移。 研究中选取了人类胸腺癌细胞肌球蛋白-A 重链，其磷酸化会依靠表皮生长因子 epidermal growth factor, EGF。 EGF 通过刺激 MDA-MB-231 细胞会导致装配与重链磷酸化的瞬时增加。 细胞经过 EGF 刺激，肌球蛋白-A重链会在酪氨酸激酶 2 位点 S1943磷酸化，肌球蛋白-A 重链 S1943E 与 S1943D 突变体会迁移到创伤位点。 相比拟而言，细胞表示出的 S1943A 突变体迁移变
21、慢，充分证明肌球蛋白-A 重链磷酸化会介导癌细胞的迁移40. 3.2.2 棘 阿米巴原虫肌球蛋白 重 链磷酸化对MgATPase 活性的调控 2020 年 Liu 等 通过研究发现了棘阿米巴原虫肌球蛋白受肌动蛋白激活的 MgATPase 活性是受肌球蛋白马达区域丝氨酸 639 磷酸化调控的， 至今为止并未发现还有其他的肌球蛋白会受这种方式来调控41. 先前揣测棘阿米巴原虫肌球蛋白有 MgATPase 活性， 这种活性能够通过两条重链 C-端非螺旋区域的重复序列中 4 个 Ser残基磷酸化来抑制， 研究者利用重组的 WT 与突变的肌球蛋白重新进行了研究， 得到了相反的结论。 HMM 与亚片段 1
22、 有受肌动蛋白激活的 MgATPase 的活性，通过磷酸化作用活性衰减。 通过质谱分析，鉴定了重链上的 5 种 Ser 能够发生磷酸化，4种 Ser 存在于非螺旋构造中，Ser639 存在于马达区域的环 2 中。 通过将 Ser639A 突变，仍然检测到肌球蛋白有 MgATPase 活性，并不会因 Ser 磷酸化而遭到抑制。 相反， 亚片段 1 与全长的肌球蛋白的Ser639D 突变失活，与 Ser 磷酸化无关。 4 小结与瞻望 肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位， 存在于平滑肌中，在肌肉运动中起重要作用。用蛋白分解酶处理能够将其分割为头部 H-酶解肌球蛋白和尾部 L-酶解肌球蛋白。 肌球蛋白作
23、为其重要功能如肌肉收缩、迁移、胞质分裂、细胞凋亡等机制中主要的调节构造域， 其磷酸化与去磷酸化在功能调控方面起着重要的作用。 研究肌球蛋白轻链与重链的磷酸化，为寻求一些肌肉收缩以及其他疾病如慢性阻塞性肺病、充血性心肌衰竭42等方面提供了重要的参考根据。更值得一提的是，近年来随着肿瘤细胞研究越来越热， 进而发现了肌球蛋白磷酸化能够介导癌细胞的迁移， 还有一些调控因子能够促进肿瘤细胞的入侵， 这为以后更好地研究癌细胞的运动提供了佐证。但其调控机制并未见太多的文章对其进行阐述，因而，肿瘤运动与迁移很可能成为将来的一个研究方向。 另外近期几年更多的研究发现，肌球蛋白不仅能够发生磷酸化，其被病毒侵袭或者
24、在激素水平 如皮质醇下，肌球蛋白被本身泛素化的报道也屡见不鲜， 但其一些作用机制与功能尚不清楚，因而，肌球蛋白泛素化有可能会成为将来继磷酸化之后的又一研究热门。 以下为参考文献References： 1 ANDRUCHOV O, ANDRUCHOVA O, WANG Y, et al. De-pendence of cross -bridge kinetics on myosin light chain iso -forms in rabbit and rat skeletal muscle fibresJ. Journal of Physiol-ogy, 2006, 571Pt 1：231-
25、242. 2 SWEENEY H L, HOUDUSSE A. Structural and functional in -sights into the Myosin motor mechanismJ. Annual Review of Bio-physics, 2018, 39 10 :539-557. 3 SANTOS M, MOURA R S, GONZAGA S, et al. Embryonicessential myosin light chain regulates fetal lung developmentin ratsJ. American Journal of Respiratory Cell and MolecularBiology, 2007, 373：330-338. 4 朱道立， 陈佩林， 王康乐。 骨骼肌肌球蛋白 II 的研究进展J.生物学教学 ZHU Dao-li,CHEN Pei-lin,WANG Kang-le.Theresearch progress of skeletal muscle myosin IIJ. Biology Teaching，201811：8-10.