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1、HSP70/CD80DNA疫苗治疗小鼠急性哮喘的作用,生物制药论文哮喘是一种免疫调节异常的呼吸系统疾病,其发病机制复杂.免疫反响异常是哮喘发生的重要环节,在哮喘中发挥关键作用1.本课题前期构建了热休克蛋白 70 ( heat shock protein70,HSP70) /CD80 DNA 疫苗,以该重组融合蛋白作为免疫原,刺激机体产生免疫应答.并观察 HSP70/CD80DNA 疫苗对小鼠急慢性哮喘的预防和治疗作用,发现其机制可能是从非特异性免疫方面恢复辅助性 T细胞 1 ( T helper cell 1,Th1) /辅助性 T 细胞 2(T helper cell 2,Th2)平衡2-3
2、.随着人们对 CD4 +T 细胞认识的逐步深切进入,发现 CD4 + CD25 + 调节性T 细胞( regulatory T cell,Treg) 和辅助性 T 细胞 17(T helper cell 17,Th17)也在哮喘的发生中具有重要作用.HSP70/CD80 DNA 疫苗在治疗哮喘的经过中能否也调节 Treg /Th17 的平衡,当前尚不清楚.本研究拟讨论 HSP70/CD80 DNA 疫苗治疗小鼠急性哮喘的作用及其对 Th1/Th2/Treg /Th17 的影响,旨在为该疫苗的临床应用提供实验基础.1 材料与方式方法1. 1 材料 健康雌性、SPF 级近交系 BALB / c 小
3、鼠购于第三军医大学; HSP70/CD80 DNA 质粒由泸州医学院附属医院感染与免疫实验室构建4;End-ofree 质粒大量提取试剂盒购于德国 QIAGE 公司;离心柱式总 RNA 提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;iScriptTMcDNA Synthesis Kit 购自美国 Bio-Rad 公司;TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII 购自宝生物工程( 大连) 有限公司;Real-time PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成.1. 2 方式方法1. 2. 1 疫苗制备 pVAX1 ( +) 质粒和 HSP70 /CD80 DNA 质粒的制备根据试
4、剂盒讲明书进行.测定纯度及浓度后,用生理盐水调整浓度到1 mg/mL备用,-20 存储.1. 2. 2 动物模型制备 BALB / c 小鼠随机分为 4组:空白对照组(空白组),哮喘模型组(模型组),pVAX1(+) 空载体对照组( 空载组) 和 HSP70 / CD80疫苗治疗组(治疗组),每组 10 只.模型制备经过中,空载组死亡 1 只小鼠.实验开场第 0 和 14 天,新鲜配制含 10 g 鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的铝佐剂混悬物 200 L,分别腹腔注射模型组、空载组和治疗组小鼠,而空白组小鼠注射等剂量生理盐水.第 17 和 25 天,治疗组小鼠股四头肌处肌内注射 10
5、0 g HSP70/CD80 DNA 疫苗,空载组注射100 g pVAX1,空白组和模型组注射等体积生理盐水.第 28 天,对模型组、空载组和治疗组小鼠以1% OVA 行雾化吸入激发,连续 7 次,30 min / 次.空白组生理盐水雾化.1. 2. 3 气道反响性检测 最后一次 OVA 雾化 24 h内,吸入乙酰甲胆碱(methacholine,Mch)后检测小鼠肺功能,全身体积描记仪记录 Penh,按下面公式计算出%基线 Penh 值:100 (检测 Penh 值 - 基线Penh 值) / 基线 Penh 值,各组进行比拟.1. 2. 4 ELISA 法检测血清 IgE 取小鼠眼球血,
6、4 000 r / min离心 10 min,收集血清,- 80 保存.1. 2. 5 观察肺组织病理学改变 切取肺组织固定于4%多聚甲醛12 h.制备切片,进行 HE 和AB-PAS染色.镜下观察炎细胞浸润、杯状细胞增生分泌情况,参照文献对炎细胞浸润和杯状细胞进行评分5-6.1. 2. 6 ELISA 法检测气管肺泡灌洗液( bronchoal-veolar lavage fluid,BALF)中细胞因子含量 注入400 L 生理盐水到主支气管,反复灌洗 3 次,吸出BALF,2 000 r / min 离心 10 min,收集上清,检测 -干扰素(interferon- ,IFN- )、白
7、细胞介素-4(inter-leukin-4,IL 4)、转 化 生 长 因 子 ( ransforminggrow th factor beta,TGF- )和白细胞介素-17(inter-leukin-17,IL 17)含量.1. 2. 7 检测肺组织中转录因子 mRNA 水平 按试剂盒讲明书进行肺组织总 RNA 提取、逆转录和Real-time PCR 反响.检测各样本 T-bet、GATA 连接蛋白 3(GATA binding protein 3,GATA3)、叉头蛋白 3(forkheah box protein3,Foxp3)和维甲酸受体相关孤儿受体 ( retinoid rela
8、ted orphan receptorgamma t,ROR t) Ct 值.根据 Ct 值,用软件 ABIStepOne 进行分析,按公式 2- CT计算各样本相对表示出量.1. 3 统计学处理 采用 SPSS 17. 0 软件.先用Shapiro-Wilk 行正态分布检验,符合正态分布即可用方差分析行多组间比拟,用 LSD 检验行多组间两两比拟,数据以x s 表示.如不符合用 Kruskal-Wallis H 检验行多组间比拟,用 Mann-Whitney U 检验行多组间两两比拟,数据以 M(P25,P75) 表示.P 0. 05 为差异有统计学意义.2 结 果2. 1 气道反响性的改变
9、 见表 1.Mch 吸入浓度到达 24 mg /mL 后,与空白组小鼠相比,模型组和空载组小鼠气道反响性升高 (P 0. 05);与模型组小鼠相比,治疗组小鼠气道反响性降低(P 0. 05).2. 2 IgE 水平的变化 模型组和空载组的血清 IgE浓度(7.45 0.81) pg/mL,(7. 08 0. 74) pg/mL高于空白组(5. 36 0. 29) pg /mL,P 0. 05;治疗组的血清 IgE 浓度(5. 91 0. 52) pg /mL低于模型组和空载组(P 0. 05).2. 3 肺组织炎细胞浸润和黏液分泌情况 见表 2、图 1.与空白组相比,模型组和空载组小鼠肺组织出
10、现大量炎细胞浸润(P 0. 05),以单核细胞和嗜酸粒细胞为主;与模型组和空载组相比,治疗组小鼠的气道、血管周围和肺泡区炎症反响减轻 (P 0. 05) .AB-PAS 染色后进行杯状细胞评分,结果表示清楚,模型组和空载组小鼠的支气管上皮中阳性杯状细胞增加(P 0. 05);与模型组相比,空白组和治疗组小鼠杯状细胞增生不明显(P 0. 05).2. 4 细胞因子的改变 见表 3.计算 BALF 上清液中细胞因子 IFN- /IL-4 和 TGF- /IL-17 比值,结果表示清楚,模型组的比值低于空白组和治疗组比值(P 0. 05).2. 5 转录因子表示出水平 见表 3.计算 T-bet /
11、 GA-TA-3 比值和 Foxp3 / ROR t 比值,结果表示清楚,模型组比值低于空白组和治疗组比值(P 0. 05).3 讨 论哮喘以气道高反响性、气道炎症和气道重建为主要特征.本研究用 OVA 致敏激发小鼠,末次雾化激发后小鼠出现上述典型异常感觉和状态,讲明模型成功建立.HSP70 是一类以分子伴侣形式维持细胞稳态的高度保守的蛋白.HSP70 能够通过干扰细胞内炎症信号转导通路而抑制炎症反响7.在哮喘的炎症反响中,HSP70 与树突细胞、单核细胞和髓系衍生抑制性细胞外表受体相结合,进而使这些细胞免疫应答活化.HSP70 还可加强 Treg 细胞因子IL-10和 TGF- 的分泌8.C
12、D80 是免疫球蛋白超家族成员,常表示出于 DCs、B 细胞、巨噬细胞等细胞外表.研究表示清楚,CD80 通过与 T 细胞外表分子CD28 和 / 或 CTLA-4 作用,为 Treg9、Th1710等 T淋巴 细 胞 活 化 提 供 共 刺 激 信 号.HSP70/CD80DNA 疫苗对急性哮喘小鼠进行干涉后,发现哮喘气道异常感觉和状态有所减轻,提示该疫苗可能对其有治疗作用.Th1 / Th2 失衡是哮喘发病的核心.Th2 活化经过中,转录因子 GATA-3 和 T-bet 发挥重要作用11.T-bet 是调节 Th1 分化的关键转录因子,它能抑制IL-4 的合成12和 Th2 的活化13.
13、哮喘时 Th2 加强,Th1 抑制,Th1/Th2 平衡向 Th2 发生偏移.本研究用 HSP70/CD80 DNA 疫苗治疗哮喘小鼠后,发现治疗组 IFN- /IL-4 比值和 T-bet/GATA-3 比值相较模型组升高,IFN- 和 T-bet 也升高,讲明该 DNA疫苗上调 IFN- /IL-4、T-bet/GATA-3,可能通过改变 Th1/Th2 失衡状态,进而发挥对哮喘的治疗作用.Treg 细胞能够抑制哮喘反响的发生.Treg 细胞分泌 TGF- 、IL-10 等细胞因子,抑制嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞的活化,减轻 Th2 细胞因子 IL-9 等的分泌,进而抑制气道炎症
14、反响.Th17 细胞能够促进哮喘反响的发生.Th17 细胞合成、分泌细胞因子 IL-17,IL-17 具有活化支气管上皮细胞的作用,使其分泌多种促炎因子,进而加重气道炎症反响14-15.Treg 和 Th17 细胞互相制约,维持平衡.转录因子 ROR t 和 STAT3 调控 Th17 细胞的活化.Treg 分化由关键转录因子 Foxp3 调节和信号转导通路 TGF- /Smad 调控.本研究结果显示,模型组 TGF- /IL-17 比值和 Foxp3/ROR t 比值降低,同时 Foxp3 降低、ROR t 升高,提示免疫平衡向Th17 发生偏移.通过疫苗治疗后,降低的 TGF- /IL-1
15、7 比值和 Foxp3 / ROR t 比值回升,TGF- 和Foxp3 也升高,讲明 HSP70 / CD80 DNA 疫苗可能通过改变 Treg /Th17 平衡,而在哮喘的治疗中发挥作用.Th1 / Th2 / Treg / Th17 细胞间并非是静止不变的,而是保持着一种动态平衡关系.与以往的研究结果一致,本研究发现 Th2、Th17 的促炎反响与Th1、Treg 的抑制炎症之间存在互相协同、互相抑制的作用.HSP70/CD80 DNA 疫苗除了通过 IFN- /IL-4 和 T-bet / GATA-3 比值的上调,以恢复 Th1 /Th2 平 衡 外,还 能 上 调 TGF- /
16、IL-17 和 Foxp3 /ROR 比值,进而恢复 Treg / Th17 平衡,最终缓解哮喘的各种气道异常感觉和状态,对其产生治疗作用.以下为参考文献:1 Pelaia G,Vatrella A,Maselli R. The potential of biolog-ics for the treatment of asthmaJ. Nat Rev Drug Dis-cov,2020,11(12) : 958-972.2 成争艳,史小玲,何光彤,等. 热休克蛋白 70 / CD80 嵌合疫苗对支气管哮喘小鼠的影响J. 中华结核和呼吸杂志,2018,32(9):716-717.3李燕,郭宇,史
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