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1、克隆与抗TYLCV有关的基因导入番茄表达分析,园艺学论文番茄Solanum lycopersicum L.生产中番茄黄化曲叶病毒为害日趋严重Czosnek Ghanim，2018。番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus简称 TYLCV，是单链环状 DNA 病毒刘玉乐 等，1998，主要依靠烟粉虱进行传播Stansly et al.，2020。与传统育种相比，基因工程育种周期短，在育种经过中不会带入其他不良农艺性状的基因，在番茄抗病毒病育种中的应用日益遭到重视。通过克隆与抗 TYLCV 有关的基因导入植物体内，有望提高植物的抗病性。 研究表示清楚，R 基因对各
2、种病原菌引发的病害均具有抗性，且在植物基因组中分布广泛Flor，1971。根据已克隆的 R 基因所编码的蛋白质保守构造及其在细胞中的位置，能够将 R 基因分为NBS-LRR 类、LRR-TM 类、STK 类、LRR-TM-STK 类和 CC 类抗病基因Hammond-Kosack Jones，1997。NBS-LRR 类基因是已经知道的 R 基因家族中最大的一类Dangl Jones，2001。比拟基因组分析表示清楚植物基因组能够编码数十个到数百个 NBS-LRR 基因，如木瓜和黄瓜的 NBS-LRR 基因有50 个，而水稻则多达 653 个Shang et al.，2018。在病毒侵染时，N
3、BS-LRR 基因驱动植物表型反响，以过敏性抗性反响和极端抗性反响两种形式抵御病毒侵染Hull，2002，且在极端抗性中病毒增殖被限制在单细胞水平，通过局部坏死病变使病毒不能在初始侵染位点扩增Lukhovitskaya et al.，2005。NBS-LRR 基因编码的 NBS-LRR 蛋白具有核苷酸结合位点NBS和富亮氨酸重复基序LRR，华而不实 NBS 包含在信号转导中，具有高度保守且严格有序的多个功能基序Tan Wu，2020，LRR 为高度灵敏的构造域，可能作为受体介入病原体的辨别和信号转导，其激酶构造域在激活其下游转导元件中发挥作用Jones Dangl，2006。当前已经知道 LR
4、R 构造域通过调控 NBS 构造域的分子状态来发挥抗病功能Takken et al.，2006。 基于番茄响应 TYLCV 侵染的转录组结果，作者前期发现了 1 个 NBS-LRR 类抗病基因在抗病番茄材料中上调表示出，并通过 VIGS 和在 TYLCV 侵染抗病番茄材料 CLN2777A 后该基因表示出量的变化表示清楚该基因有一定的抗病功能Chen et al.，2020。本试验中进一步克隆该 NBS-LRR 类抗病基因 ClNLR，通过荧光定量 PCR 发现 ClNLR 在番茄 CLN2777A 根和叶片中高水平表示出，且通过抗、感番茄材料接种 TYLCV 后 ClNLR 表示出量的比照和
5、在本氏烟中的瞬时表示出，进一步证明了该基因与番茄抗病性相关。同时再次通过 VIGS 试验对接病前后番茄抗病材料 CLN2777A 的表型进行了观察，并通过荧光定量 PCR 验证了前期的试验结果。 1、 材料与方式方法 1.1 试验材料 抗 TYLCV 番茄材料 CLN2777A 和感 TYLCV 番茄材料 TMXA48-4-0 由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。携带TYLCV的烟粉虱为连续饲养于防虫温室番茄上的试验种群。pTRV1、pTRV2和 pTRV2-PDS 质粒由清华大学刘玉乐教授馈赠。大肠杆菌 DH5 、根瘤农杆菌 LBA4404、GV3101、质粒 pBI121 均为本实验室保存。
6、表示出载体质粒 CaMV35S 由本实验室在 pBI121 的基础上改造而成。 TA 克隆载体 PGEM-T 载体、限制性内切酶Xba、BamH、Sac、T4DNA 连接酶、DNA 聚合酶、DNA 分子量标准均购自 TaKaRa 公司，其他试剂为国产分析纯试剂。TIANamp Genomic DNAKit、血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒购自 TIANGEN 生物公司，质粒提取试剂盒、PCR 清洁试剂盒、DNA 片段快速纯化/回收试剂盒购于 AXYGEN 公司。引物序列由 Primer 5.0 引物设计软件评价生成，并委托上海英骏公司合成。 1.2 ClNLR 的克隆与序列分析 在前
7、期的研究中，从 CLN2777A 和 TMXA48-4-0 番茄材料接种 TYLCV 前后的转录组NCBIsra 数据库登录号 SRP028618中发现 1 个响应 TYLCV 侵染而上调表示出、注释为含有 NBS-LRR 构造域的抗性基因Solyc05g009760.1，通过初步的功能验证，表示清楚该基因有一定的抗病功能Chen et al.，2020。 根据 Solyc05g009760.1 基因序列，用 Primer 5.0 软件设计扩增基因编码区全长的特异引物 P3：5 -TTCACAAGACTTTAGATGTGGCAT-3 及 P4：5 -AGTAGTTCTTGGGGATATGAAG
8、TTG-3 ，以抗病材料 CLN2777A cDNA 为模板，参照 PrimerSTAR 高保真酶反响体系扩增该基因序列。PCR 反响条件为：94 预变性 3 min；94 30 s，58 40 s，72 2 min 30 s，35 个循环；72 10 min。 将回收的 PCR 产物连接至 PGEM-T 载体后转化大肠杆菌 DH5 ，转化子经菌落 PCR 鉴定为阳性克隆后送至上海英骏公司测序。所获得的基因序列命名为 ClNLR 基因。用在线软件 Conserved Domains分析保守构造域。 1.3 ClNLR 在 TYLCV 诱导下的表示出分析 将番茄材料 CLN2777A 和 TMX
9、A48-4-0 以携带 TYLCV 的烟粉虱进行 TYLCV 接种 5 d后，提取叶片 RNA，M-MLV Reverse TranscriptaseMBI 公司反转录合成 cDNA。以 ActinAB199316为内参，荧光定量 PCR 检测 ClNLR 基因的表示出情况。ClNLR 和 Actin 引物分别为 ClNLR-forward：5 -CTTTGCGGGTTCGTTCATCTTAT-3 ；ClNLR-reward：5 -CGTTTATGTCCACATGCCTCAAC-3 ；Actin-forward：5 -TGGTCGGAATGGGACAGAAG-3 ；Actin-reward：5
10、 -CTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3 。荧光定量 PCR 反响体系为 20 L：2 SYBR Premix Ex Taq?10 L，引物各 1 L，cDNA模板 1 L，超纯水 7 L，混合加样。PCR 反响程序为 96 预变性 1 min，95 变性 15 s，60 退火 15 s，72 延伸 45 s，40 次循环。试验设置 3 个生物重复。 1.4 ClNLR 的组织表示出分析 提取番茄抗病材料 CLN2777A 根、茎、叶片、花蕾和果实 RNA，每个样品取 500 ng RNA，反转录成 cDNA 后稀释 1 000 倍，取 2 L 进行荧光定量 PCR 反响。基因特异引物
11、、内参引物、荧光定量 PCR 的反响体系和反响程序参照 1.3 的方式方法。试验进行 3 个生物学重复。 1.5 ClNLR 在本氏烟的瞬时表示出 以获得的ClNLR 基由于模板，通过 PCR 扩增在ClNLR基因两端引入BamH和Sac酶切位点。PCR 引物为 P5：5 -CATGGATCCGGCATTGTTAATCATTAGAGTATG-3 引入 BamH酶切位点和 P6：5 -ACTGAGCTCTTAGTAGTTCTTGGGGATATGAAG-3 引入 Sac酶切位点。植物表示出载体 pBI121 和 PCR 产物分别经用 BamH和 Sac双酶切，于 16 连接过夜。取 5 L 连接产
12、物转化大肠杆菌 DH5 ，在固体 LB附加 50 mg L-1卡那霉素培养基上 37 培养过夜，单克隆提取质粒 DNA 并经酶切验证后命名为 pBI121-ClNLR。pBI121-ClNLR 质粒通过冻融法转化农杆菌LBA4404。 将含有pBI121-ClNLR的农杆菌接种于液体LB附加50 mg L-1卡那霉素和25 mg L-1利福平、28 培养过夜。取培养液离心弃上清，沉淀重悬于缓冲液10 mmol L-1MES，10 mmol L-1MgCl2，200 mol L-1乙酰丁香酮内，调整 OD600值至 0.5，用无针头 1 mL 无菌注射器将农杆菌悬浮液压入5 6片真叶期的本氏烟的
13、半边叶片，另一半边叶片注射以同样方式方法获得的pBI121-GFP作为对照。 农杆菌注射后的烟草在培养箱中22 ，75%空气湿度，黑暗培养 2 d，转入人工气候室培养28 ，16 h/8 h 光照周期，观察表型变化。 1.6 VIGS 沉默 ClNLR 基因 以pBI121-ClNLR为模板，PCR克隆出283 bp的ClNLR基因片段P7：5 -GTATCTAGAGTGTTGTATGTCCGTGGCTGAC-3 和 P8：5 -CATGGATCCGAGAACCCAATGAC TCCCTGC-3 。用 Xba和BamH酶切 PCR 产物和病毒载体 pTRV2，然后将该基因片段克隆至 pTRV2
14、 中，构建 ClNLR 基因的沉默载体 pTRV2-ClNLR。 质粒 pTRV1、pTRV2、pTRV2-PDS 和 pTRV2-ClNLR 采用冻融法转化农杆菌 GV3101。将转化成功的农杆菌 28 过夜培养，离心弃上清后重悬于缓冲液10 mmol L-1MES，10 mmol L-1MgCl2，200 mol L-1乙酰丁香酮中，调节 OD600值至 2.0，室温放置 4 6 h 后，将含有 pTRV2-ClNLR、pTRV2-PDS 和 pTRV2 空载体的农杆菌悬浮液分别与含有 pTRV1 的农杆菌悬浮液按 11 的比例混合，用无针头 1 mL 无菌注射器将农杆菌悬浮液注入抗病番茄
15、材料 CLN2777A 子叶期幼苗的子叶中。华而不实，注射 pTRV1 + pTRV2 空载体的植株为阴性对照，注射 pTRV1 + pTRV2-PDS 的为阳性对照，番茄幼苗一直在 22 25 、相对湿度 50%、16 h/8 h 的光照周期下生长。 当注射 pTRV1 + pTRV-PDS 的番茄叶片上出现光漂白现象时，提取 pTRV1 + pTRV2-ClNLR 的番茄上端嫩叶总 RNA；并用 oligodT合成第一链 cDNA，然后通过荧光定量 PCR 检测 ClNLR 基因的沉默效果，定量引物及反响条件参照 1.3。 1.7 ClNLR 基因沉默对番茄体内 TYLCV 含量的影响 选
16、取 ClNLR 基因沉默的番茄植株和注射 pTRV1 + pTRV2 空载体的番茄植株同时置于密闭的防虫温室，烟粉虱接种 TYLCV 后 7 d 时，用 CTAB 法提取番茄叶片总 DNA。用 SHIMADZU 公司的BioSpec-nano/230v 型号的微量分光光度计测定总 DNA 浓度后，将其稀释为终浓度 300 ng L-1备用。荧光定量 PCR 检测番茄植株体内的 TYLCV 积累，以 Actin 为内参。华而不实检测 TYLCV 病毒含量的引物为 TY-AV494：5 -GCCYATRTAYAGRAAGCCMAG-3 和 TY-COPR：5 -GANGSATGHGTRCADGCC
17、ATATA-3 ，Actin 引物及荧光定量 PCR 的反响条件参照 1.3。 2、 结果与分析 2.1 ClNLR 基因的克隆 作者前期通过比拟番茄材料 CLN2777A 和 TMXA48-4-0 接种 TYLCV 前后的转录组NCBIsra 数据库登录号 SRP028618，发如今接种 TYLCV 后，1 个 NBS-LRR 类抗性基因Solyc05g009760.1在抗病材料 CLN2777A 中上调表示出，而在感病材料 TMXA48-4-0 中则无明显变化Chen et al.，2020。 本试验中进一步通过 PCR 克隆该基因，鉴于该基因的注释功能为 NBS-LRR 抗病基因将之命名
18、为 ClNLR。构造分析表示清楚 ClNLR 基因编码蛋白在 N 端第 43 323 位氨基酸为保守构造域 NB-ARC，480 721 位氨基酸序列为典型的 LRR 构造域图 1。 2.2 ClNLR 基因的表示出分析 为了验证 ClNLR 基因的转录组表示出结果，利用荧光定量 PCR 检测 ClNLR 响应 TYLCV 侵染的表示出情况。抗病番茄材料 CLN2777A 和感病番茄材料 TMXA48-4-0 通过烟粉虱接种 TYLCV，5 d 后 ClNLR 在抗病材料中表示出量相比接种前上调了约 12 倍，而在感病材料中则无明显变化图 2，基因表示出变化趋势与转录组结果Chen et al
19、.，2020基本一致。荧光定量 PCR 进一步检测 ClNLR 基因在抗病番茄 CLN2777A 中的组织表示出情况，发现 ClNLR在根部表示出最强，其次为叶片，在果实中表示出最弱图 3。 2.3 ClNLR 瞬时表示出引起本氏烟过敏性反响 将含有 ClNLR 基因植物表示出载体的农杆菌通过农杆菌浸润法注射本氏烟叶片 15 d 后，注射 ClNLR 基因的一侧叶片上出现了坏死斑，而注射 GFP 基因的另一侧叶片没有任何变化图 4，表示清楚 ClNLR 基因诱导了本氏烟过敏性反响，可能与植物抗病防卫反响相关。 2.4 沉默 ClNLR 基因影响番茄 TYLCV 抗性 为了研究ClNLR在番茄中
20、抗TYLCV的作用，本试验中通过TRV沉默抗病番茄的ClNLR基因。番茄幼苗注射 TRV 沉默载体 15 20 d后，注射 pTRV1 + pTRV2-PDS 的阳性对照植株新叶出现光漂白现象，随着时间推移，叶片出现光漂白现象愈明显图 5，表示清楚 VIGS 沉默成功。 此时提取 pTRV1 + pTRV2-ClNLR 处理的番茄嫩叶总 RNA，通过荧光定量 PCR 检测发现 3 株独立 VIGS 处理的番茄植株 ClNLR 基因的表示出水平下降至阴性对照的 40% 80%图 6。这些 pTRV1 + pTRV2-ClNLR 处理的番茄通过烟粉虱接种 TYLCV 7 d 后，荧光定量 PCR
21、检测发现抑制ClNLR基因表示出可使番茄体内的TYLCV含量增加，且ClNLR基因表示出水平与其体内TYLCV积累量成反比图 6，图 7，但 ClNLR 基因表示出下降的番茄植株接种后没有出现典型的叶片黄化、卷曲等番茄黄化曲叶病病症图 5，这可能是由于 CLNLR 的沉默效率没有能到达使基因表示出完全被抑制的水平，低表示出的 ClNLR 仍能维持植株一定的抗性。 3、 讨论 植物对病毒的抗性大概能够描绘叙述为基因网络中基因的互相作用和信号传递途径抑制了病毒的复制和移动，以及诱导产生的小分子介导了抗性基因的活化Culver Padmanabhan，2007。抵抗TYLCV 的分子和生化机制仍不清
22、楚Gorovits et al.，2007，因而描绘 TYLCV 的抗性网络并开掘抗性基因是至关重要的。为了到达这个目的，开展了番茄响应 TYLCV 侵染的转录组研究，还发现ClNLR 基因Solyc05g009760.1可能介入抵抗 TYLCV 侵染的防卫反响Chen et al.，2020。在这里基础上，本试验中进一步克隆了该 ClNLR 基因图 1。荧光定量 PCR 证实 ClNLR 基因在抗病番茄材料上调表示出，而在感病材料中无明显表示出变化图 2，初步讲明 ClNLR 基因在抗病番茄中能够响应 TYLCV 的侵染。ClNLR 基因在本氏烟叶片上的瞬时表示出可产生过敏性反响图 4，VI
23、GS 抑制抗病番茄材料 ClNLR 基因的表示出提高了 TYLCV 在番茄叶片中的积累量，且番茄 ClNLR 基因表示出水平与其体内 TYLCV 积累量成反比图 5、图 6、图 7，表示清楚该基因可能介入了番茄抗 TYLCV 的防卫反响。ClNLR 基因在番茄的根和叶片中表示出最高图 3，可以能与其抗病功能相关。 ClNLR 编码的蛋白质含有 NBS-LRR 抗病蛋白的特征构造域，其 N 端为 1 个典型的 NB-ARC 构造域，C 端含有 4 个 LRR 保守构造域，是典型的 NBS-LRR 类抗病基因的构造图 1。NBS 在细胞的生长与分化、小泡运输、细胞骨架构成及防御反响中都具有重要作用
24、Pan et al.，2000。NB-ARC构造域分布于真核生物的很多蛋白中，如 GTP 结合蛋白、ATP 合成酶 亚基、核糖体延伸因子elongation factors异质三聚体、R 基因编码蛋白等且它在蛋白与蛋白互作中作为一个功能组件发挥作用，比方嘌呤核苷酸的结合通常被以为是改变了 R 蛋白与防御信号传导途径中其它成员间的互相作用Bent，1996。而具有特异辨别的氨基酸残基大部分位于 LRRs，可构成多种配基结合域作为 R 蛋白的受体区域，配基结合、介入蛋白与蛋白间的互作、蛋白与碳水化合物结合，并能特异性辨别病原物来源的信号分子。在对拟南芥 NBS-LRR 类抗病基因 RPS5 的 L
25、RR 突变体研究中发现，它不仅介入信号的辨别还介入了下游信号的传导Wang et al.，1998。根据 ClNLR 的构造特征，揣测该基因可能通过与病原的效应子进行结合而抑制病原在植物细胞中定植和扩展，进而在番茄抗病防御经过中发挥作用。 在缺少相应 Avr 产物的情况下，有时候 R 基因的过表示出也会引起 HR 反响。例如番茄的 Pto 基因Tang et al.，1999，拟南芥的 RPS2 基因Tao et al.，2000和烟草的 L 基因Frost et al.，2004。 这些数据表示清楚信号级联反响能够在缺少病原物的情况下被激活。这种强烈的过敏性坏死反响在 R 蛋白 RPS2 和
26、 RPS5 中通过 CC 区域和 NB-ARC 片段CC-NB-ARC诱导产生Tao et al.，2000；Juleset al.，2007。而在 RPS4 和 RPP1A 抗性蛋白中，TIR-NB-ARC 便足以诱导 HRZhang et al.，2004；Weaver et al.，2006。ClNLR 编码的蛋白不包含 TIR 和 CC 构造，哪个构造域引发了 HR 反响以及从 R 蛋白到 HR 免疫反响的信号转导途径仍有待进一步的研究。 病毒诱导的基因沉默已经发展为研究植物基因沉默的有效工具Purkayastha Dasgupta，2018。 如今最常用的一种病毒载体为烟草脆裂病毒L
27、iu et al.，2002；Brigneti et al.，2004。Czosnek 等2020通过比拟抗感番茄材料的 cDNA 文库和 VIGS 的方式方法，挑选并鉴定出 25 个在抗病番茄材料中优先表示出的基因，华而不实 5 个基因的沉默使抗性瓦解，并指出番茄对 TYLCV 的抗性存在多层次关系，华而不实SlVRSLip 基因在 LEHT1 基因的下游发挥作用Sade et al.，2020。从图 6 和图 7 中能够看到，VIGS抑制 ClNLR 基因表示出的 1、2 植株接种 TYLCV 后，带毒量都显著增加，植株 3 的 ClNLR 基因表示出水平和接病后的带毒量与对照相差不大，可能是由于该基因在植株 3 中没有被有效沉默。值得注意的是，烟粉虱接种供试番茄植株后，即便显著沉默的番茄也未出现番茄黄化曲叶病病症，可能是由于ClNLR基因的沉默效率不高，没有能使基因的表示出被完全抑制或抑制到感病的水平，可以能是ClNLR基因只是抗病反响中的下游防卫基因并非抗病关键基因。通过接种其他病原物鉴定该基因能否具有广谱抗性能够更好阐释 ClNLR 基因在抗病反响中的作用。