《富血小板血浆取代胎牛血清用于间充质干细胞的体外扩增,医学工程论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《富血小板血浆取代胎牛血清用于间充质干细胞的体外扩增,医学工程论文.docx（8页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、富血小板血浆取代胎牛血清用于间充质干细胞的体外扩增,医学工程论文间充质干细胞( mesenchymal stem cells，MSCs) 是一种未分化细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我复制以及在一定条件下向骨、软骨、脂肪和肌肉等组织细胞分化的能力。因而，以 MSCs 为基础的细胞疗法得到广泛的研究，并且在临床上开展应用。在临床应用的准备阶段，MSCs 需要在体外进行大量扩增。胎牛血清( fetal bovine serum，FBS) 能为细胞的增殖、迁移和分化等生物学行为提供营养、生长因子和激素等生物活性物质，是应用于细胞培养的最常见物质。然而，FBS 含有的大量异种蛋白，应用于临
2、床可能引来一系列伦理和免疫风险，美国食品和药品管理局已经严格限制了FBS 应用于临床。当前大量的研究在探寻求索用富血小板血浆( platelet-richplasma，PRP) 取代 FBS 用于 MSCs 的体外扩增。 1 PRP 的生物学特性 PRP 是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，一般含有大量的血小板和少量的其他血细胞。血小板中含有丰富的生长因子，包括血小板源性生长因子( platelet-derived growthfactor，PDGF) ，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子，转化生长因子 和血管内皮生长因子，这些细胞因子在细胞的增殖经过中都发挥着重要作用。PRP 还含有
3、人 防御素 2，能够有效预防大肠埃希菌、宏大芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和奇异变形杆菌的感染。 由于个体差异以及不同的制备经过，比方血小板的分离( 两次离心法或者血液成分除去法) ，血小板的裂解( 不同的温度，冻融的次数) ，血小板残渣的去除( 离心的速度和时间)等，会导致 PRP 中各细胞成分不同，生长因子的浓度和活性也各不一样。与合成代谢相关的细胞因子 PDGF、转化生长因子 的浓度与血小板的浓度呈正相关，与分解代谢相关的细胞因子基质金属蛋白酶 9、白细胞介素 1 的浓度与中性粒细胞的浓度呈正相关，除此之外白细胞介素 1 的浓度还与单核细胞的浓度呈正相关。 PRP 应用前需用一定方式方
4、法激活，通过血小板的黏附、凝集或者破裂将生长因子从血小板 颗粒中释放出来。与此同时白细胞的破裂还伴有促炎性细胞因子的释放。当前常用凝血酶、氯化钙或者反复冻融的方式对 PRP进行激活。Textor 等将马血样本制备的 PRP 分别用自体凝血酶、牛凝血酶、氯化钙和反复冻融等 4 种方式进行激活，酶联免疫吸附测定 PDGF-BB 和转化生长因子 1在 PRP 上清液中的浓度并进行统计学分析。氯化钙激活的 PRP 中 PDGF-BB水平显着高于其他激活方式，而转化生长因子 1在氯化钙、牛凝血酶和反复冻融激活的 PRP 中释放水平相当。自体凝血酶在激活血小板释放生长因子方面显着不如其他方式方法，因而不建
5、议使用自体凝血酶作为 PRP 的激活剂。氯化钙可释放血小板中 80%的 PDGF，是一种经济、高效的激活剂。考虑到牛凝血酶作为异种蛋白应用于临床同样存在病毒传播、免疫抑制及凝血功能障碍等一系列潜在风险，而氯化钙中的钙离子对科研经过存在干扰，李洪涛等尝试用液氮冻融方式方法裂解血小板，经过比拟发现，液氮冻融激活的洗涤血小板在一定浓度下能够显着促进人牙髓细胞的增殖，而且比牛凝血酶激活的 PRP 效果更好。由此可见，针对不同的临床应用，应采用不同的 PRP 制备方式方法。 迄今为止，国际上仍无公认的 PRP 制备方式方法，不同学者应用各自方式方法制备的 PRP 作出的实验结论不具备可比性。 对 PRP
6、 进行标准化，使 PRP 的使用具有可靠性和重复性，保证科研和临床质量，是一项亟需解决的工作。Amable 等发现，采用同一标准化流程制备和激活 PRP，可避免由于静脉血采集自不同志愿者引起的个体差异，使华而不实的生长因子含量保持相对一致水平。临床工作中，一般采用将多人份来源的血小板混合，制备成混杂 PRP 以减少批次间的差异，并由此获取大量的 PRP。 2 PRP 对干细胞体外增殖的作用 与 FBS 相比，PRP 能够显着促进骨髓间充质干细胞( bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、脂肪间充质干细胞、肌肉干细胞、肌腱干细胞等的增殖，增加克隆构成率和
7、纤维母细胞集落构成单位大小，减少到达汇合的时间。国内多位学者对 PRP 促进牙髓干细胞增殖的作用进行了研究。赵晟楠等用全自动血液细胞分析机采集人血小板并制备 PRP，发现 1%20%PRP 具有促进牙髓干细胞生长增殖的效应，其效果近似 10% FBS。唐凤勤等应用两步离心法制备 PRP，研究结果显示 10% PRP 促进牙髓细胞增殖作用强于一样浓度的 FBS，并且明显好于 5% 和 20% 的 PRP。 同时发现参加 PRP 后细胞形态发生明显的变化，由原来的长梭形，变为胞体减小、突起增加的极性细胞，将 PRP 去除后细胞又恢复原来的形态和生长速度。李威等研究了不同浓度的 PRP 对犬牙髓成纤
8、维细胞的促增殖作用，以为随着 PRP浓度的增加，对牙髓成纤维细胞的增殖作用经历下面 3 个阶段: 细胞的增殖与 PRP 的浓度呈正比; PRP 到达一定浓度，细胞的增殖反响呈饱和状态，细胞的增殖与 PRP 的浓度无关; 当 PRP 的浓度继续升高，细胞的增殖与 PRP 的浓度呈负相关。即 PRP 对细胞增殖的作用为低浓度时刺激生长、高浓度时抑制生长的双向反响。段建民等的研究也支持PRP 只在一定浓度范围内能够促进牙髓细胞的增殖，他们发现将 PRP 中的血浆去除后对牙髓细胞增殖的促进作用更强，提示可能血浆成分中存在对抗牙髓细胞增殖的因素。 PRP 的促增殖作用与其细胞成分密切相关。PDGF 在促
9、进细胞增殖方面可能起了关键的作用，用抗体选择性阻断PDGF 后，PRP 的促增殖作用被显着抑制。含有白细胞的PRP 比不含白细胞的 PRP 释放碱性成纤维细胞生长因子的速度更快，促进 BMSCs 增殖的能力更强。脐带血来源的PRP 因含有更多的未分化细胞，其促增殖能力比静脉血来源的 PRP 更强。 PRP 的促增殖作用依靠于各种生长因子的协同作用。 这些生长因子能够激活血小板源性生长因子受体/磷脂酰肌醇 3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/核因子 B 信号通路，提高旁分泌水平，促进细胞再生，使细胞耐受不良环境的能力更强，减缓细胞的凋亡。 Pawitan 等分析了 10 篇用 PRP 替代 FBS
10、 用于细胞培养的研究，大部分研究以为 PRP 用于骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs) 和脂肪间充质干细胞培养时优于或至少等效于 FBS，对于 PRP 的最佳有效浓度没有一致的结论，归因于 PRP 制备方式的不同。 将人的成骨细胞和自体 PRP 共培养，经流式细胞术检测，成骨细胞的细胞周期没有发生改变，PRP 的促进增殖作用随着时间的延长渐渐消失，因此不会引起细胞的无序增殖。Bieback 等的研究显示，在 BMSCs 与 PRP 共培养的体系中未检测到自发性的细胞转化，在所有代数细胞中未检测到端粒酶活性。PRP 促进细胞增殖的
11、作用与细胞的状态有关，对不同年龄段志愿者的 BMSCs 进行培养发现，老年志愿者来源的细胞增殖能力显着降低。这些研究讲明 PRP不改变细胞的性状，不会导致细胞恶性变。 3 PRP 维持干细胞干性的作用 干细胞的干性，即干细胞保持自我更新和多向分化的能力，有赖于干细胞的不对称分裂。一个母代干细胞通过不对称分裂产生一个子代干细胞和一个祖细胞，祖细胞再分化为终末细胞。干细胞在体外扩增时，一方面细胞群体数量要增加，更为重要的是要保持多向分化的能力。 通过比拟血小板裂解物和 FBS 对马的 BMSCs 体外培养，发如今两种培养基中细胞的产出率、成纤维细胞集落生成单位、细胞倍增时间等方面无明显差异; 除此
12、之外，两种培养基中的细胞均可检测出干细胞的标记基因 Sox2、Oct4 和 Klf4，证明两种培养基中的细胞均保持了干细胞特性。 利用 PRP 替代 FBS 对脂肪干细胞进行体外培养，细胞具有更高层次的增殖率，且终生保持干细胞特异性外表标志物和多向分化能力。在对肌肉干细胞的研究中发现，PRP 在促进细胞增殖和维持多向分化能力的同时，还保持了干细胞特有的免疫抑制性。 但是，PRP 培养的 MSCs 细胞形态较小，大多表现为纺锤形，且多成簇聚集。PRP 对干细胞外表的黏附因子可能有一定的影响，Bernardo 等的研究发现 PRP 培养的 BMSCs 与培养瓶附着较松，在从培养瓶上分离时用胰蛋白酶
13、水解时间较短。但另一针对脂肪干细胞的研究却得出相反的结论，以为 PRP 培养的脂肪干细胞与塑料培养瓶的附着更紧。 4 结 语 FBS 从胎牛体内获取，需要将怀孕的母牛处死，当前的制取方式方法会导致大量胎牛的死亡; FBS 的成分不确定，每一批次间各种成分的含量千差万别，因而在科学研究中容易造成误差，影响试验的可重复性; FBS 作为一种外源性血清，应用于临床可能引起免疫排挤反响，甚至可能将牛的病毒、细菌等病原体传播至人。所以，MSCs 应用于临床前不宜用 FBS 进行体外培养。从当前研究成果能够看出，大部分的研究者以为PRP 能够替代 FBS 应用于 MSCs 的体外扩增。PRP 在促进MSCs 大量增殖的经过中，不改变细胞的性状，维持 MSCs 的免疫抑制能力和多向分化能力。下一步，应对 PRP 的制备方式方法和性状进行标准化，进一步提高科研和临床工作的可靠性和重复性，以利于大量制备和商业推广。