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1、研究围孕期母鼠叶酸缺乏对胎鼠发育的影响,发育生物学论文叶酸folate是在绿叶蔬菜、谷物和动物肝脏中发现的一种 B 族维生素，主要介入 DNA 合成和甲基化经过，对胎儿的生长发育至关重要。近年研究发现， 母体低叶酸水平可能会增高胎儿宫内发育延迟缓慢Intrauterine Growth Retardation, IUGR的发生率,但其分子机制尚不清楚；以往动物模型的研究提示叶酸缺乏会引起胎鼠重量下降,但也没有对其进一步的机制讨论。 当前以为，IUGR 的病因是多种因素作用的结果， 其病因学包括环境因素和遗传因素。现今很多研究证实胰岛素生长因子insulin-like growth factor
2、, IGF、瘦素leptin、葡萄糖转运蛋白Glut及凝血因子等与胎儿 IUGR 密切相关.胰岛素或IGF 分泌和功能的异常，是当前研究的热门.IGF 是生长发育所必需的、起重要作用的生长调节因子， 是胎儿出生前和出生后生长的主要刺激物，与婴儿出生体重密切相关.IGF 系统包括胰岛素生长因子IGF-、胰岛素生长因子IGF 、胰岛素生长因子受体IGF-R、胰岛素生长因子受体IGF R、胰岛素生长因子结合蛋白 1IGFBP-1和胰岛素生长因子结合蛋白 3IGFBP-3等，IGF-、IGF 构造类似于胰岛素，是重要的促分裂素，影响细胞生长和代谢，并通过自分泌、旁分泌和内分泌方式影响细胞增殖和分化，调
3、节机体的生长发育.最近有研究表示清楚，叶酸缺乏会导致孕鼠血清和孕18 天胎鼠颅骨中 IGF-1 蛋白含量降低;韩国 Kim HW 的一项研究也表示清楚雄鼠叶酸缺乏会导致子代胎鼠脑中 IGF的表示出量下降,这讲明叶酸缺乏可能会影响 IGF 系统相关基因的表示出水平。 本实验通过建立叶酸缺乏孕鼠模型，研究围孕期母鼠叶酸缺乏对胎鼠发育的影响，并在叶酸主要存储器官肝脏组织中测定了 IGF 系统相关基因表示出水平，进而对叶酸缺乏致胚胎异常发育的机制进行了初步的讨论。 1 材料与方式方法 1.1 材料 C57BL/6J 清洁级雌性成年小鼠 12 只购自中国医科院实验动物中心，饲料配方中的氨基酸、维生素等购
4、自美国 Sigma公司。实时荧光定量 PCR 仪7500 fast 为 ABI 公司产品；Nan-odrop 1000 分光光度计为 Thermo Scientific 公司产品；引物自上海生物工程技术有限公司合成；荧光染料 SYBR Green I 购自康为世纪公司；RNA 提取试剂盒购自美国 QIAGEN 公司；RNA 反转录试剂盒购自美国 Invitrogen 公司。 1.2 方式方法 1.2.1 动物模型的制备 健康清洁级未经产的成年 C57BL/6J 雌鼠 12 只，12 周龄，体重 19.1-21.2 g.按体重排序，随机分为正常对照组Control和叶酸缺乏组FD两组，每组 6
5、只。对照组小鼠喂养饲料以 AIN-93G 标准饲料配方为基础，华而不实氨基酸、矿物质和维生素混合物按 Bills N.D.等人建立的氨基酸限定配方进行调整；叶酸缺乏组小鼠喂养饲料是在对照组基础上剔除掉叶酸，详细成分详见表 1.两组小鼠皆自由进水和饮食，所有雌鼠先饲养于普通塑料笼具内单笼喂养，4 周后与正常成年C57BL/6J 雄鼠 1:1 合笼交配。每日下午 17:00 合笼，次日清晨检查阴栓，阴道口有乳白色或黄色凝固物者为见栓，记为 E0.5d,后转入普通饲养笼中，继续喂饲各自饲料直至取材。本研究使用的动物由实验动物使用与管理委员会审查许可编号：IL-AS-PL-2020-001。【表1】
6、1.2.2 实验记录及取材 每周用电子天平称量雌鼠体重，准确至小数点后一位数。取材时间为孕 13.5 天13.5 dpc当天的 8:0010:00,记录孕鼠每窝总胎数、活胎数、吸收胎数和死胎数；测量记录胎盘重量、胎鼠重量、胎鼠体长。计算并统计胎鼠 IU-GR 比率，以正常对照组胎鼠平均出生体重减去该组标准差的2 倍为基准，胎鼠重量小于或等于此标准者评定为 IUGR.取13.5 dpc 胎鼠肝脏组织，每一窝胎鼠的组织放入同一个冻存管中，液氮速冻，-80冰箱保存。 1.2.3 实时荧光定量 PCR 称取 13.5 dpc 小鼠胚胎肝脏组织 20mg,每组各 6 个标本，采用离心柱法提取总 RNA,
7、Nanodrop1000 分光光度计测总 RNA 浓度。采用 Real-time PCR 法检测肝脏组织中 IGF、IGFR、IGF-、IGF-R、IGFBP-1 和 IGF-BP-3 mRNA 的水平，引物序列见表 2.Real-time PCR 反响体系20 L,扩增反响条件为：50 20 s、95 10 min 后，以 95 15 s、60 1 min 循环 40 次，每份样本做三个重复孔。采用与内参基因 Gapdh 比拟的CT 法计算 IGF mRNA 的相对表示出量。【表2】 1.3 统计学处理采用 SPSS 16.0 软件，数据以 SEM 表示，组间计量资料的比拟采用独立样本 t
8、检验，吸收胎与死胎的比率、IUGR 发生率的比拟采用 X2检验，P 0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 两组雌鼠体重的变化 随机分组的两组雌鼠的初始体重没有统计学差异P 0.05，在分别饲以相应饲料后，与正常对照组相比，叶酸缺乏组雌鼠合笼前四周体重每日的增长量降低，差异有统计学意义P 0.05；而孕后至取材时的雌鼠体重每日的增长量两组间没有差异不同P 0.05表 3。【表3】 2.2 两组孕鼠吸收胎和死胎发生率的比拟 在 13.5 dpc 取材时叶酸缺乏组的胎鼠总数为 51 只，华而不实吸收胎 14 例；正常对照组的胎鼠总数为 54 只，华而不实吸收胎 3例，死胎 3 例；与对照
9、组相比，叶酸缺乏组吸收胎和死胎率升高1.47 倍，X2检验结果显示，两组差异具有统计学意义P 0.05 表 4。【表4】 2.3 胚胎发育评价及 IUGR 发生率的比拟 两组孕鼠每组 6 只解剖结果发现，叶酸缺乏组有 37 例活胎，正常对照组有 48 例活胎，为两组间胎鼠的形态比照图，可见叶酸缺乏组胎鼠体型偏小。与对照组相比，叶酸缺乏组平均胎鼠重量显着降低，是正常对照组胎鼠重量的 74.06 %,差异具有显着性P 0.01。计算统计两组间胚胎 IUGR 的发生率，分析发现叶酸缺乏组显着高于正常对照组，差异有统计学意义P 0.001。胎盘重量和胎鼠顶臀长分析结果显示叶酸缺乏组略低于正常组，但没有
10、统计学差异P 0.05表 5。【表5】 2.4 胎鼠肝脏 IGF 系统基因相对表示出量变化 胎鼠肝脏标本中 IGF 系统 mRNA 的相对表示出水平分析结果显示，叶酸缺乏组 IGF-和 IGF-R mRNA 水平均低于正常对照组，分别降低 58.45 %和 32.64 %,且两组间差异有统计学意义P 0.05；相反，IGF、IGFR、IGFBP-1 和 IGFBP-3 的mRNA 相对表示出水平，两组间没有统计学差异P 0.05。 3 讨论 3.1 叶酸缺乏与胚胎发育叶酸作为一种水溶性维生素，介入 DNA 的合成与甲基化，对细胞的生长至关重要，近年来很多文献报道发现叶酸和胎儿发育关系密切。Sr
11、am RJ和 Relton CL 等人发如今早期妊娠的孕妇和新生儿中，有吸烟习惯的孕妇叶酸水平降低，且新生儿体重普遍偏低，两者高度相关。巴基斯坦的 Lindblad B发现IUGR 组母血和脐血中叶酸的水平是正常对照组的一半；澳大利亚的 Furness D 学者发现妊娠 18-20 周、发生 IUGR 的孕妇中，红细胞叶酸水平低于对照组，同型半胱氨酸homocysteine,Hcy高于对照组，并且在淋巴细胞可见 DNA 损伤的标志 - 微核和核质桥现象增加，这表示清楚在妊娠中期母体的低叶酸和高Hcy 水平与 IUGR 相关。印度的 Gadhok AK通过采集妊娠晚期 150 名 IUGR 和
12、30 名正常孕妇的血样，比拟 Hcy、叶酸和VB12 的水平，发现 IUGR 组孕妇血清 Hcy 的浓度高于对照组，而叶酸和 VB12 的浓度低于对照组。国内的蔡卫华分别研究了不同孕期的 IUGR 孕妇，发现 IUGR 组各孕期红细胞叶酸水平均低于对照组，且新生儿体重与母血红细胞叶酸水平密切相关。综上所述，妊娠早期、中期、晚期孕妇本身的低叶酸水平都会导致新生儿 IUGR 的发生率上升。 叶酸缺乏动物研究结果也发现，低叶酸饮食母鼠的怀孕率降低，孕鼠的孕期体重增加减少，孕鼠宫内活胎数减少，吸收胎、死胎比率增加，胎鼠重量下降，而大部分活胎的大体形态学都显示正常.Xiao S 等建立的叶酸缺乏模型是在
13、饲料中添加 0.033 mg/kg、0.066 mg/kg、0.132 mg/kg 等不同含量的叶酸，并且参加 1 %的琥珀磺胺噻唑ss以抑制肠道叶酸的合成，膳食干涉 8 周后合笼。Heid、Burgoon 等建立模型的方式方法与前者类似，不同的是在小鼠合笼前分别膳食干涉 5 周和 4 周.本实验中叶酸缺乏组小鼠采用剔除叶酸的饲料配方，以控制外源性叶酸的摄入；并且为了最大程度地模拟孕妇在围孕期的低叶酸状态，并且便于独立评价叶酸缺乏对胚胎发育的不良作用，本实验并未采用 ss 肠道抑制剂，以排除其对胚胎发育的潜在影响。小鼠胚胎的器官构成期为第 10-14 天，因而我们选择13.5 dpc 器官构成
14、的末期来观察叶酸缺乏对中孕期胚胎发育的影响。Bills N.D.等曾采用此方式方法成功建立了叶酸缺乏的小鼠模型，干涉 5 周后发现小鼠体重、肝脏和红细胞等的叶酸含量都明显下降。廖国仪等人也采用类似方式方法建立了叶酸缺乏的孕鼠模型，通过孕前干涉 2 周，发现孕晚期E20 d胎鼠的平均体重、鼻 - 臀长、脑重均低于对照组。本实验中雌鼠妊娠结局与上述文献结果一致，叶酸缺乏组雌鼠合笼前体重增长下降，孕鼠中吸收胎和死胎比率升高，胎鼠重量低于正常对照组，这讲明在小鼠的孕中期，叶酸缺乏引起的胎鼠发育受限就已经得到了具体表现出。以往实验虽表示清楚叶酸缺乏会导致胎鼠重量下降，但均未严格的采用 IUGR 断定标准
15、计算比率，本实验采用标准差法初次描绘叙述并断定了叶酸缺乏致小鼠胚胎 IUGR 的发生率。 3.2 IGF 表示出与 IUGRIGF 系统包括两种配体IGF-， IGF-，两种受体IGF-R, IGF-R、六种 IGF 结合蛋白IGF-binding proteins, IGFB-Ps、IGFBP 相关蛋白 IGFBP-related proteins, IGFBP-rPs 和一组 IGFBP 蛋白酶.IGFs 在局部组织环境中通过自分泌和 或旁分泌机制，配体和受体相结合，激活下游效应因子，发挥促有丝分裂作用， 并可诱导细胞分化和促进很多细胞分化后功能表示出。IGFBPs 是与 IGF-、IGF
16、-有高结合力的一组蛋白，循环中 IGFs 的浓度随着 IGFBPs 的变化而变化，它们是 IGFs 生物功能的调节剂，能将 IGFs 转运并定位到特定的细胞中，延长循环中 IGFs 的半衰期以调控其促生长活性，华而不实 IGFBP-3 在血中的含量最高，是 IGFs 的主要载体蛋白，IGFBP-1 也能快速调节血浆中 IGFs 的活性， 并可在细胞水平上调节 IGFs 的物质.研究表示清楚，IGFs 是调节胎儿生长发育的重要物质之一，亦是控制胎儿生长有效的有丝分裂素.由于肝脏是动物中叶酸存储和代谢的主要器官,也是产生 IGFs 的主要器官，所以我们选取胎鼠肝脏标本为研究对象，讨论 IGF 系统
17、基因的表示出变化。 IGF-是重要的胚胎期生长因子，可在胎盘中调控糖原合成及合成细胞的量, 是调节葡萄糖转运的主要因子。IGF-不但能够促进细胞的增殖、分化、成熟，还可抑制细胞的凋亡；它能够介导生长激素的大部分作用，可促进机体的生长和合成代谢，并有调节免疫、降低血糖等作用，它还在肌肉和脂肪组织中具有胰岛素样作用，可通过和胰岛素 A 型受体高亲和性的结合进而发生细胞丝裂效应.IGFs 的生物学功能需要通过特异性的 IGF- 受体介导完成， IGF-R、IGF-R 两种受体分别与各自的配体以高亲和力结合， 只存在 10 %的穿插配体.IGF-R 是一种分布于细胞胞质和高尔基体上的跨膜糖蛋白，它在处
18、于活泼踊跃增殖期的胚胎肝脏细胞内呈现高表示出状态。自分泌生长刺激机制是肝癌细胞恶性增殖的重要原因，而 IGF-与IGF-R 的过量表示出可能是华而不实一个分子基础.在本实验中叶酸缺乏组 13.5 dpc 胎鼠肝脏中 IGF-、IGF-R 的表示出量均低于正常对照组，讲明两者可能存在协同作用。Calvo MT 等研究证实，IUGR 胎儿 IGF 基因表示出明显受抑制。多项国内研究，通过比照分析 IUGR 孕妇和正常孕妇在孕中期及分娩时羊水、母血、脐血中 IGF 系统的表示出，发现无论在孕中期还是分娩时，IUGR 组脐血或羊水中 IGF-水平都较对照组显着降低. 动物研究发现，IGF-基因敲除鼠显
19、示出明显的 IUGR 及胎盘缩小， 虽生后可显示近似正常的生长速率， 但实际体重、身长仍低于正常对照鼠，同时敲除 IGF-及 IGF-基因鼠显示严重 I-UGR, 所有鼠生后均死于呼吸衰竭.另外，Lassarre 等发现，IGF-基因过度表示出， 胎儿体重及生长发育速度明显增加。以上实验结果证实了 IGF-和 IGF-R 在胎儿生长发育中的重要作用，与 IUGR 密切相关。 3.3 叶酸缺乏与 IGF Santoso MI研究过叶酸缺乏与 TGF- 1 和 IGF-表示出量之间的关系，发现叶酸缺乏组母鼠血清和胎鼠颅骨中 TGF- 1和 IGF-的表示出量都比对照组低；最近 Kim HW的研究表
20、示清楚父体叶酸缺乏会导致子代胎鼠脑部整体甲基化降低，并使 IGF-蛋白表示出量下降。研究提示叶酸缺乏会影响 IGF 系统中相关基因的表示出，而在本实验建立的叶酸缺乏小鼠模型中，胎鼠肝脏组织 IGF-和 IGF-R 的表示出量也发生了类似下降。由于叶酸为蛋氨酸合成所必需，而蛋氨酸的代谢中间物 S- 腺苷蛋氨酸在甲基转移酶的作用下转变为 S- 腺苷同性半胱氨酸的经过为体内广泛存在的甲基化反响提供甲基，而 DNA 的甲基化是调控基因表示出的重要形式。有研究表示清楚，IGF-基因的差异性甲基化区DMR 去甲基化状态使其能与加强子阻遏蛋白CTCF 结合，CTCF 能阻断加强子对 IGF-基因启动子的作用
21、，使 IGF-不能有效地转录，进而降低 IGF-基因的表示出.在本实验中，IGF-表示出水平的降低，可能是由于母鼠的叶酸缺乏状态影响 IGF-基因 DMR 区的甲基化程度引起的。由于体内循环中 IGF 因子减少，可能无法知足细胞生长的正常生理需要，进而影响胚胎的生长发育。 综上所述，本文通过建立围孕期叶酸缺乏的小鼠模型，研究了母鼠叶酸缺乏对胎鼠发育和肝脏 IGF 系统基因表示出的影响，结果表示清楚叶酸缺乏会引起孕中期小鼠 IUGR 率增高且降低13.5 dpc 胎鼠肝脏内 IGF-和 IGF-R 的表示出水平。研究结果提示，叶酸缺乏对 IGF 系统基因的调控，可能介入到胎鼠 IUGR率增高的机
22、制之中。胎儿的生长是多因素共同作用的，本文对与胚胎发育关系较密切的部分 IGF 基因进行了测定， 除 IGF-和 IGF-R 的表示出量发生变化外，其他基因未发生变化。在后续研究中，将扩大样本量，检测组织叶酸浓度，并对 IGF 基因的甲基化程度进行测定，进一步讨论叶酸缺乏改变 IGF 基因表示出、影响胚胎发育的机制。 以下为参考文献References 1 Lindblad B, S Zaman, A Malik, et al. Folate, vitamin B12, and homoc-ysteine levels in South Asian women with growth-reta
23、rded fetuses J.Acta Obstet Gynecol Scand, 2005, 8411： 1055-1061 2 Xiao S, DK Hansen, ET Horsley, et al. Maternal folate deficiency res-ults in selective upregulation of folate receptors and heterogeneous nu-clear ribonucleoprotein-E1 associated with multiple subtle aberrationsin fetal tissues J. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2005, 731：6-28 3 杨慧敏， 孙轶， 周天鸿， 等。 叶酸缺乏孕鼠子代脑组织 DNA 甲基化变化 J. 营养学报， 2004, 263： 187-191Yang Hui-min, Sun Yi, Zhou Tian-hong, et al. Effects of maternal fol-ate deficiency on DNA methylation J. Acta Nutrimenta Sinica, 2004,263： 187-191