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1、NF-B对凋亡相关基因表达的调节作用研究,细胞生物学论文Kerr 等1在 1972 年初次提出了细胞凋亡的概念，从此开启了对细胞凋亡的探寻求索之路。细胞凋亡是由基因调控的细胞自主有序的主动死亡经过，又称程序性细胞死亡，以细胞固缩、染色质浓集、凋亡小体的构成及细胞核 DNA 片段化为主要的形态特征，其信号转导机制复杂，主要包括 3 条通路，即细胞内的线粒体通路、内质网通路和细胞外的死亡受体通路2. NF- B 是细胞核内重要的转录调节因子，不仅介入机体免疫、炎症、组织损伤修复和胚胎发育等经过，还能够调节凋亡相关基因的表示出3.研究表示清楚，NF- B与多种凋亡相关基因的易感性与耐药性密切相关，在
2、细胞存活与凋亡经过中起到双刃剑的作用4. 1 NF- B 概述 1.1 NF- B 家族 NF- B 是 NF- B /Rel 蛋白家族成员之一，当前在哺乳动物中已发现有 5 种 NF- B /Rel 蛋白，包括 p50 又称为 NF- B 1,由前体蛋白 p105 产生 、p52 又称为 NF- B 2,由前体蛋白 p100 产生 、RelA p65 ,RelB 和 c-Rel.每一个 NF- B /Rel 蛋白家族成员的 N 端都含有 Rel 同源构造域，包括核定位信号序列、二聚化区域、DNA 结合区和 I B 结合位点。p65,RelB 和 Rel 的 C 端含有转录激活域，华而不实富含
3、丝氨酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸，能直接作用于转录元件并激活转录经过。除了 p52和 p50 外，这些蛋白两两结合成具有 NF- B 活性的不同转录因子复合物，华而不实 p65/p50 是存在最广泛且是当前研究最多的二聚体复合物。 1.2 NF- B 的激活 NF- B 的激活途径主要包含经典途径和旁路途径5-6.细胞在静息状态时，NF- B 通常以非活性的 p65/p50/NF- B 抑 制 因 子 inhibitor ofNF- B- ，I B- 三聚体复合物形式存在于细胞质中，三聚体复合物能够被多种因素激活，包括细胞因子如白细胞介素 6 interleukin-6,IL-6 和 IL-1
4、7、肿瘤坏死因子 tumor necrosis factor- ，TNF- 、细菌内毒素脂多糖 lipopolysaccharide,LPS 、蛋白激酶 C 和理化因素 X 射线、氧化剂及化疗药物制剂 等。在上述激活物的刺激下，细胞中 I B 激酶 I B kinase ，IKK 发生磷酸化，进而磷酸化 I B氨基端丝氨酸残基的第 32 和第 36 位点，磷酸化的I B 被泛素酶泛素化，随后发生构象改变并降解，导致 NF- B 的核定位信号序列暴露，并易位到细胞核，与下游靶基因的加强子位点结合，进而启动靶基因的转录和表示出，这是当前研究最清楚的经典途径。旁路途径局限于淋巴器官，仅少部分刺激物
5、如淋巴毒素 等 通过该途径激活 NF- B,由 NF- B 诱导激酶 NF- B inducing kinase,NIK 介导 IKK 激活，进而使前体蛋白 p100 降解生成 p52,与 RelB 构成异源二聚体，进入细胞核与靶基因结合并启动其表示出7. 除此之外，尚存在不规则的 NF- B 激活途径，此途径是在 DNA 损伤的细胞中发现的。细胞遭到紫外线照射或抗肿瘤药物等刺激后，引起 DNA 损伤，p38 丝裂原激活蛋白激酶 p38 mitogen-activatedprotein kinase,p38MAPK 激 活 酪 蛋 白 激 酶 2 casein kinase 2,CK2 ,后者
6、介导 I B 磷酸化，引起 I B 泛素化后降解，继而激活 NF- B,以类似经典途径的方式，诱导下游靶基因表示出。因而，p38-CK2-I B 也是激活 NF- B 的途径之一8. NF- B 活化的调节方式有正反应调节和负反应调节9.细胞在外界刺激作用下，活化的 NF- B 激活 IL-1 和 TNF- 等，这些基因表示出上调后反向活化NF- B,进一步刺激 IL-6 和 IL-8 等释放，导致炎症信号放大10,此经过为正反应调节。NF- B 的负反应调节存在于细胞内和细胞外。细胞内 NF- B 活化促进 p105 和 I B 的表示出上调，一定程度上限制了NF- B的活化速度； 同时，p
7、50 的同源二聚体增加，与有转录活性的 NF- B 竞争 DNA 结合位点，降低 NF- B介导的炎症效应。细胞外 LPS,TNF- 和 IL-1 等激活 NF- B 的同时也使反向调节因子 IL-4,IL-10 及IL-13 释放增加，后者能够抑制 NF- B 的活化。 2 NF- B 在线粒体凋亡通路中的调节作用 线粒体途径是细胞凋亡的一个主要途径。线粒体通透转变孔 mitochondrial permeability transi-tion pore,MPTP 的开放是导致细胞死亡的主要原因。MPTP 开放后，线粒体跨膜电位降低，细胞色素c cytochrome c,Cyt c 等促凋亡
8、活性蛋白释放至胞浆中11,在 dATP 作用下，Cyt c 与凋亡蛋白酶活化因 子 1 apoptotic protease activating factor,Apaf-1 构成多聚复合体，启动胱天蛋白酶级联反响，导致细胞凋亡。 2.1 抑制凋亡作用 NF- B 在线粒体通路中的抑制凋亡作用可通过对细胞凋亡抑制蛋白 inhibitor of apoptosis pro-teins,IAP 家族成员 X 连锁 IAP X-linked IAP,XIAP ,c-IAP-1 和 c-IAP-2 等 的 转 录 调 节 来 实现12.XIAP 是 NF- B 发挥抑制凋亡作用的关键因子，能特异性地结
9、合并抑制凋亡效应因子胱天蛋白酶 3,7 和 9 的活化，进而阻断细胞中 Cyt c 的释放，进而抑制凋亡13.Wang 等14报道，NF- B 诱导 c-IAP-1,c-IAP-2,TNF 受体 1 TNF receptor-1,TNFR1 和 TNFR2 基因共同表示出，抑制胱天蛋白酶 8活化，阻断 Cyt c 释放进而起到抑制凋亡作用。Yu 等15发现，抑制 NF- B 的活化可下调 c-IAP-1和 c-IAP-2 的表示出，进而加强由化疗药物 CPT-11诱导的结肠癌细胞凋亡。 另外，NF- B 的抑制凋亡作用可以通过上调抗凋亡基因的表示出实现。Bcl-2 家族蛋白控制着线粒体膜的通透
10、性，在线粒体凋亡途径中起关键作用。Bcl-2 家族中抗凋亡蛋白 Bcl-2 和 Bcl-xL 上有 B结合位点，NF- B 活化后，线粒体膜上的 Bcl-2 基因和 Bcl-xL 基因表示出增加，线粒体膜的通透性降低，阻断了 Cyt c 的释放，进而抑制细胞凋亡16-17. 2.2 促进凋亡作用 Shou 等18报道，SD 大鼠脑局部缺血时，海马中NF- B 的激活使 Bcl-2 家族中促凋亡基因 Bcl-X,Bax 的表示出上调，引起凋亡。Tamatani 等19研究证实了这一结果，并发现此促凋亡途径可被 I B 抑制。 3 NF- B 在内质网凋亡通路中的调节作用 内质网通路即通过内质网应
11、激 endoplasmicreticulum stress,ERS 诱导凋亡。细胞遭到刺激后，如钙稳态紊乱和氧化应激等，引起内质网中未折叠或折叠错误的蛋白质累积进而引发凋亡。ERS主要通过 CHOP C/EBP homologous protein 转录激活、胱天蛋白酶 12 活化和c-Jun氨基端激酶 c-Jun N-terminal kinase,JNK 信号活化等 3 条途径启动细胞凋亡。研究表示清楚，NF- B 与 ERS 介导的 JNK 信号通路有密切联络20-21. JNK 是 MAPK 家族成员之一，可调控细胞内外不同的应激反响。细胞在应激状态下，需肌醇蛋白酶 1 活化，激活 J
12、NK 进而诱导细胞凋亡。Xia 等22在大鼠嗜铬细胞瘤 PC-12 细胞的培养经过中初次发现 JNK 的促凋亡作用。大量研究表示清楚，NF- B 活化能够抑制 JNK 介导的细胞凋亡。Nakano 等23发现，可通过 NF- B 活化下调细胞内活性氧的水平，进而抑制 JNK 的级联反响信号，到达抑制凋亡的目的。Benedetti 等24报道，通过 TNF- 诱导肾小管近端小管上皮细胞凋亡的经过中，NF- B 信号转导遭到抑制，JNK 信号通路被激活并级联放大，最终导致细胞凋亡。在 TNF- 介导肝细胞毒性实验中，敲除 IKK 基因后，NF- B 的信号转导遭到抑制，JNK 转录水平上调，促进肝
13、细胞的损伤； 而在剔除 JNKl 或 JNK2 基因后，JNK 的转录遭到抑制，减轻了肝细胞损伤25.上述研究表示清楚，NF- B 通过抑制 JNK 信号起到抗凋亡的作用。 4 NF- B 在死亡受体凋亡通路中的调节作用 死亡受体途径指胞外的死亡信号通过死亡受体转入胞内诱发细胞凋亡。死亡受体均属 TNFR 基因超家族，其胞外部分富含半胱氨酸的区域有蛋白水解的功能，称为 死亡构造域 , 死亡构造域 使死亡信号得以进一步传递进而启动凋亡。当前已经知道的死 亡 受 体 主 要 有 Fas 又 称 CD95 分 子 ,TNFR1,TNFR2,DR3,DR4 和 DR5,前 4 种受体的配体分别为 Fa
14、sL,TNF,TNF 和 Apo-3L DR3L ,后 2 种均为 Apo-2L,即 TNF 相关凋亡诱导配体 TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL ,华而不实最典型的死亡受体是 Fas 和 TNFR. 4.1 抑制凋亡作用 细胞内 Fas 与配体 FasL 结合后，启动死亡域并募集 Fas 相关死亡构造域蛋白，构成死亡诱导信号复合物。死亡诱导信号复合物构成后引起胞质内胱天蛋白酶原 8 procaspase 8 激活，后者自我剪切活化后进一步激活下游的胱天蛋白酶 3 和胱天蛋白酶 7,启动胱天蛋白酶级联反响，引起细胞凋亡。 研究表示清楚，激活
15、NF- B 能够抑制由 Fas/FasL 信号通路引起的凋亡。Chen 等26报道，邻苯二甲酸单乙基己酯通过激活 NF- B 抑制睾丸支持细胞的凋亡，基因敲除死亡区域相关基因后，募集到 FasL 启动子区域的 NF- B 数量减少，引起Fas/FasL基因表示出增加，促进了睾丸支持细胞的凋亡。Wang等27报道，使用 NF- B 的抑制剂 Bay 11-708,能够加强由 Fas 介导的人白血病细胞 HL-60 凋亡。另外，Fas 相关死亡域蛋白样IL-1 转化酶抑制蛋白 Fas-associated death domain protein-like IL-1 converting enzy
16、me inhibitory protein,FLIP ,在Fas 介导的凋亡通路中发挥重要的抗凋亡作用，是由于 FLIP 基因序列上有 B 结合位点，可上调 FLIP基因表示出，抑制胱天蛋白酶级联反响的活化进而抑制凋亡28.Travert等29研究发现，由 TNF- 或者CD40 配体诱导的 NF- B 活化可上调 FLIP 的表示出水平，进而抑制 Fas,TNFR1 和 TRAIL 介导的凋亡。 另外，TNF 是一类重要的效应分子，主要通过TNFR1 和 TNFR2 受体介导发挥生物学效应，这两种受体通过消耗 I B 进而激活 NF- B,活化的NF- B可上调 TNFR 相关因子 TNFR
17、-associatedfactors,TRAF 家族成员 TRAF1,TRAF2 及 IAP家族成员 c-IAP-1 和 c-IAP-2 等的表示出进而抑制凋亡30-31.Chang 等32发现，通过 发夹 RNA 敲除TRAF2 的蛋白激酶 C 相关激酶 1 相关蛋白后，NF- B的活性显著降低，TNF- 诱导的凋亡细胞数量显著增加。 4.2 促进凋亡作用 Jennewein 等33研究发现，由死亡受体介导而引起恶性胶质瘤细胞凋亡的实验中，过表示出 I B 超级抑制剂 I B -super repressor 使 NF- B 的活性遭到抑制，由 TRAIL 和 Fas 诱导的凋亡细胞数量显著
18、减少。相反，IKK 过表示出引起 NF- B 活化，显著增加 TRAIL 介导的凋亡细胞数量。Jayasooriya等34报道，在人肝癌细胞 HepG2 凋亡实验中，NF- B的活化引起 Fas 表示出上调，可促进疣孢菌素 verrucarine A/TRAIL 介导的细胞凋亡。另外，在对 TRAIL 信号活化途径的研究中，也发现当 p65 过表示出时，抑制细胞凋亡，而当 c-Rel 表示出增加时，则促进细胞凋亡35. 5 瞻望 NF- B 是多功能转录因子，有广泛的生物学作用。活化的 NF- B 在细胞凋亡中有抗凋亡和促凋亡的双重调节作用，但在何种条件下起抗凋亡或促凋亡作用尚不明确。NF-
19、B 在凋亡中的双向作用可能解释如下： 不同种类和不同表示出水平的NF- B亚基与靶基因启动子区域结合，进而选择性影响凋亡经过； 细胞中与 NF- B 同时被激活的其他转录因子，由于代谢状态的不同可影响 NF- B的最终效应； 细胞种类、细胞生长环境、外界刺激物种类和刺激强度不同，均可导致 NF- B 的不同效应。研究 NF- B 在细胞凋亡通路中的调节作用，有助于开发细胞凋亡信号转导途径中相应蛋白分子的冲动剂或拮抗剂，在受体水平或受体传递环节上干扰细胞凋亡经过，对凋亡相关疾病的治疗具有重要意义，同时还可为新药开发提供研究思路。 以下为参考文献： 1 Kerr JF,Wyllie AH,Curr
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21、bitors ofapoptosis are global regulators of NF- B and MAPKactivation by members of the TNF family of receptorsJ. Sci Signal,2020,5 216 : ra22. 4 Jayasooriya RG,Moon DO,Park SR,Choi YH,Asami Y,Kim MO,et al. Combined treatment withverrucarin A and tumor necrosis factor- sensitizesapoptosis by overexpression of nuclear factor-kap-paB-mediated FasJ. Environ Toxicol Pharmacol,2020,36 2 : 303-310. 5 Bonizzi G,Karin M. The two NF-kappaB activationpathways and their role in innate and adaptiveimmunityJ. Trends Immunol,2004,25 6 : 280-288.