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1、海藻糖对镉致大鼠肝脏毒性的作用机制,兽医硕士论文Cadmium (Cd) is a widely distributed environmental contamination. Cd is absorbed by humans or animals via contaminated food, air and water, then accumulated in the body. Cdexerts strong toxic effects on different organs and tissues such as liver, kidney, testis, spleen and bo
2、ne, et al. As one of the most active organs of oxidative stress, the liver is also the important target organ for cadmium toxicity. Trehalose(Tr) protects against oxidative stress-mediated cytotoxicity through its antioxidant properties. The effect and mechanism of Tr antagonizing the toxicity of he
3、avy metal Cd in vivo has not been elucidated. Thus, this study intend to explore the protective effect of Tr on Cd induced hepatotoxicity in rats and the possible protective mechanism. In this study, 32 SD rats were randomly divided into 4 groups: control group (Cont group), cadmium treatment group
4、(Cd group), trehalose protection group (Cd+Tr group), andtrehalose group (Tr group). The corresponding treatments were given to each group of rats,Cd Cl2 solution replaced drinking water in Cd group and Cd+Tr groups, Tr solution wasadministered daily in Cd+Tr group and Tr group, and the other groups
5、 were treated with corresponding control methods. After 8 weeks, the rats were anesthetized and sacrificed,blood samples and liver tissue samples were taken for corresponding detection. Firstly, serum biochemical indicators (three liver function marker enzymes: ALT, AST,and LDH) and liver histologic
6、al changes were tested in the test rats. The results showed that Cd can significantly increase the activity of three serum enzymes and cause obvious histological damage to the liver. Tr significantly reduced the Cd-elevated serum biochemical parameters , and alleviated the Cd-induced liver histologi
7、cal damage, indicating that Tr antagonizes the toxicity of Cd and exerts the liver-protecting effect. Secondly, in order to investigate the protective mechanism of trehalose, this study measured the biomarker level of oxidative stress in serum (MDA, T-AOC, GSH, SOD, GPx and CAT) to examing the effec
8、t of Tr on Cd-induced oxidative stress. The results indicate that Tr alleviates Cd-induced whole body lipid peroxidation. Thirdly, in view of the regulatory role of Nrf2 signaling pathway in oxidative stress, this study further explored the role of Nrf2 signaling pathway in Tr mitigate Cd-induced he
9、patic oxidative damage. The results showed that trehalose significantly inhibited the Cd-activated Nrf2 signaling pathway and down-regulated the expression of Cd-enhanced enzymatic antioxidant proteins (CAT, GPx, SOD1 and SOD2), which may be due to when trehalose enters the body through itself antio
10、xidant properties replace Nrf2-activated endogenous antioxidant enzymes to exert antioxidant effects. Fourthly, the expression of LC3 and SQSTM1/p62 protein was detected by Western blotting and immunohistochemistry to investigate the effect of Tr on the Cd-induced autophagy inhibition.The results sh
11、owed that Tr can alleviate the inhibition of autophagy induced by Cd. Finally,the apoptosis rate of liver cells was detected by TUNEL staining and the expression levels of cleaved-PARP, cleaved-caspase-9 and cleaved-caspase-3 were analyzed by Western blotting. We found that Tr inhibits Cd-mediated h
12、epatic cell apoptosis by blocking caspase-dependent apoptosis pathway. In summary, we found that cadmium-induced oxidative stress is closely related to the activation of Nrf2 signaling pathway. Cadmium-induced oxidative stress also promotes autophagy inhibition and hepatocyte apoptosis in rats. As a
13、n autophagy promoter, trehalose also has an antioxidant effect, which can alleviate cadmium-induced oxidative stress and activation of the Nrf2 pathway, thereby restoring autophagy and inhibiting apoptosis to exerting the protective effect on Cd-induced hepatotoxicity. Key words: cadmium; liver; oxi
14、dative stress; autophagy; apoptosis; trehalose。 1.前言。 1.1、镉的污染大概情况。 镉(cadmium Cd)是一种延展性良好，具有银白色金属光泽的重金属。随着Cd在工业和农业生产中的广泛应用，Cd致的污染也日益严重Liu et al., 2021。环境中的Cd主要通过下面方式进入人体：职业性镉暴露主要来自有色金属冶炼吸入含镉废气，非职业性镉暴露主要来自于香烟，食物链和水赵伟 等，2005。Cd的半衰期有10至25年之久，一旦进入机体，就会长时间蓄积并且持续发挥其毒性作用，引起机体肝脏、肾脏、骨骼、脑等多器官的损害，对生殖系统和免疫系统也具有
15、严重毒性作用李光先 等，2021；Chen et al., 2021。 据统计，当前人类年均镉排放量约为100万吨，足以导致环境Cd污染，严重威胁人和动物健康。20世纪30年代日本的 痛痛病 是由于神通川河上游的神冈矿山排放废水镉含量严重超标所致污染了下游水及水稻，进而造成了镉中毒刘莉莉 等，2021。有统计表示清楚，我们国家有1/6的耕地超过2000万公顷受重金属污染，在华东6个地区随机采购检测大米样品，有大约10%镉超标。2020年1月，广西龙江镉污染事件直接危及下游群众饮水安全。引起广泛关注，Cd污染威胁到人类的生活和健康，因而Cd污染问题已经步入公众视野，成为当下研究的热门问题。 1.
16、2、镉的毒性研究。 1.2.1、镉的代谢。 镉是一种对人体具有毒副作用的重金属，过量镉摄入会对机体产生很多负面影响，如癌变和细胞凋亡等。镉主要通过呼吸道、消化道或者皮肤被机体吸收，消化道中的镉吸收率为5%10%，呼吸道中的镉吸收率为10%40%皮会丰，2021。被机体吸收入血的镉，结合含琉基的白蛋白为主的血浆蛋白，随血液运输至机体各组织器官。肾脏与肝脏是镉主要的靶器官，4060岁正常人类体内镉总量约30 mg，肾脏和肝脏中镉含量分别占机体总量的15%以上，其余广泛分布于脑、胰、睾丸等器官李会英，2018；Li et al., 2018；Shao et al., 2020。镉主要通过尿液排泄，少
17、量通过胆汁途径排泄。镉被机体吸收进入血循环后，可诱导肝脏合成金属硫蛋白，并与镉结合后构成镉-金属硫蛋白复合物(Cd-MT)，Cd-MT可经血液运转到肾脏李慧 等，2021。 1.2.2、镉对机体的毒性作用。 镉在体内蓄积时间以及生物半衰期长，使其成为已经知道生物体内最易蓄积的重金属陈忠翔，2020。急性或慢性镉中毒均会导致机体组织损伤，并且能损伤包括肝脏、肾脏、骨骼、脑在内的多个器官。如仅摄入少量镉，可以使人出现乏力，头痛，胃痛，甚至全身性骨骼疼痛，骨质疏松等异常感觉和状态，摄入高浓度镉会导致机体死亡黎晓峰，2007。已证实Cd所诱导的氧化损伤反响是其生物体毒性的主要原因，Cd通过刺激机体产生
18、过量ROS、导致脂质过氧化发挥其对机体的生物毒性牟素华 等，2003。Cd能够通过其诱导的氧化应激，加速机体衰老，诱导肿瘤发生，造成多器官损伤钱燕 等，2021。研究发现Cd还能够损伤DNA，主要包括：直接损伤DNA和损伤DNA修复董峰 等，2021。当前关于Cd诱导的生殖系统毒性研究表示清楚：镉中毒能够干扰内分泌，进而损伤哺乳动物生殖系统；镉中毒能够损伤啮齿类动物和哺乳动物的性腺组织；而且，摄入大量镉能够导致雄鼠急性持续性睾丸损伤张凌燕，2021。除此之外，镉被证实通太多种途径诱导生物体的细胞凋亡，有体外研究表示清楚低剂量镉能够导致雌性机体生殖细胞凋亡李雪霞 等，2021。 1.2.3、镉的
19、肝毒性机制。 肝脏作为机体重要的解毒器官，同时也是镉蓄积的主要靶器官Babaet al., 2020。通过很多体内外研究已经证实镉的肝毒性作用，镉对禽类动物肝脏，肾脏均具有明显毒性作用孙昊宇，2021；Dai et al., 2021。镉毒性还能够引起多种慢性肝脏损伤：镉能够损伤鸡肝脏组织，导致鸡肝细胞核膜分离，线粒体峭断裂，以及严重的肝细胞凋亡；急性镉中毒还能够引起小鼠肝脏多种病理损伤，包括肝脏细胞肿胀，炎性细胞浸润和肝细胞死亡范婷婷 等，2021。 关于镉致肝中毒机制，有研究表示清楚Cd可改变细胞膜通透性，使其它有害物质更易进入细胞进而引起细胞毒性损伤吴晓刚 等，2006。还有研究证明，C
20、d可毁坏鸡肝细胞钙稳态，肝细胞中GRP 94，Bax，Caspase-3转录水平升高，由此表示清楚镉能够通过内质网应激进而诱导肝细胞凋亡邵成成，2020。镉能够介导大鼠肝细胞氧化应激，刺激肝细胞产生大量超氧阴离子、过氧化氢和自由基等活性氧物质，进而导致氧化和抗氧化失衡，最终导致肝脏细胞凋亡。镉因其非氧化复原特性，可结合GSH，进而减少GSH含量，导致ROS去除障碍，加剧脂质过氧化进而诱导细胞DNA损伤邓思平 等，2020。镉能够拮抗机体锌、硒、铜和钙等必需金属元素，进而干扰细胞膜运输和能量代谢等多种细胞代谢经过李宁，2008。 【由于本篇文章为硕士论文，如需全文请点击底部下载全文链接】 1.3
21、、氧化应激的概述 1.3.1、 镉与氧化应激 1.3.2 、Nrf2/Keap-1通路的简述 1.4、 细胞自噬的概述 1 4.1、自噬水平的检测 1.4.2、 细胞自噬与氧化应激 1.5、细胞凋亡的概述 1.5.1 、细胞凋亡的检测方式方法 1.5.2、 细胞凋亡与氧化应激. 1.6、海藻糖的性质及应用 1.7、 研究目的与意义 2. 材料与方式方法 2.1、实验材料 2.1.1、实验动物 2.1.2、试验设计 2.1.3、 样品采集 2.2、主要试剂 2.3、主要仪.器 2.4、相关实验试剂的配制 2.4.1、氯化镉配制方式方法 2.4.2、海藻糖溶液配制方式方法 2.4.3、组织固定液配
22、置方式方法 2.4 4、 Western Blot电泳缓冲液配制方式方法 2.4.5、WesternBIot转膜缓冲液配制方式方法. 2.4.6、TBS溶液配制方式方法 2.4.7、 1X TBST工作液配制方式方法 2 4.8 、30%丙烯酰胺配制方式方法. 2.4.9 、10% SDS配制方式方法. 2.4.10、 10%过硫酸铵(APs)配制方式方法 2.4.11、 5%脱脂奶粉封闭液配制方式方法 2.5、试验方式方法 2.5.1、血清生化指标的测定 2.5.2、组织切片的制备 2.5.3 、HE染色方式方法 3.5.4、免疫组化 3.5.5 、TUNEL染色 2.5.6 、Wester
23、n Blot样品制备、电泳及显影 2.5.7、统计学分析 3、结果及分 3.1、海藻糖对镉致肝损伤的保卫效应 3.1.1、血清中肝损伤标志酶活性的变化 3.1.2、肝脏组织学变化. 3.2、海藻糖对镉致大鼠氧化应激血清指标的影响 3.2.1、氧化应激终产物MDA水平的变化 3.2.2 、T-AOC水平的变化 3.2.3、三种酶性抗氧化剂活性的变化 3.2.4、非酶性抗氧化剂GSH水平的变化 3.3、海藻糖对Cd所激活NrE信号通路的影响 3.3.1、肝细胞内Nrf2定位的检测 3.3.2 、Nrf2与Keapl蛋白水平变化 3.3.3 、HO-1与NQO1蛋白水平变化 3.4、海藻糖与镉对肝内
24、抗氧化蛋白表示出水平的影响 3.5、海藻糖对镉致肝脏自噬抑制的影响 3.5.1、肝组织内p62蛋白水平变化 3.5.2、肝组织内LC3- II蛋白水平变化 3.6、海藻糖对镉介导大鼠肝脏细胞凋亡的影响 3.6.1、大鼠肝脏细胞凋亡率的变化 3.6.2、凋亡标志蛋白水平的变化 4、讨论 1.海藻糖对镉致肝损伤的保卫效应 2.氧化应激在Tr对Cd致肝损伤保卫中的角色 3.细胞自噬在Tr对Cd致肝损伤保卫中的作用 4.细胞凋亡在Tr对Cd致肝损伤保卫中的作用 5、结论 1海藻糖通过其抗氧化特性缓解镉诱导的肝损伤。 2海藻糖作为抗氧化剂替代大鼠肝脏内源性抗氧化防御，减弱大鼠肝脏中镉激活的Nrf2信号通路。 3海藻糖能够减轻镉诱导的氧化应激和Nrf2通路激活，恢复自噬和抑制细胞凋亡，进而拮抗镉诱导的肝毒性。 以下为参考文献