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1、基于全局转录工程策略构建吡咯喹啉醌生产菌,基因工程论文 吡咯喹啉醌 ( PQQ) 是 异 于 NAD/NADP 和FMN / FAD 的新型辅酶,能刺激微生物生长、促进神经细胞和生长因子的合成、调节机体自由基水平、保卫脑功能、加强对毒性和辐射的耐受性,并且有望成为治疗帕金森病的候选药物。迄今发现能合成 PQQ 的生物主要是革兰氏阴性菌,包括副球菌属( Paracoccus) 、假单胞菌属( Pseudomonas) 、乙酸钙不动杆菌属( Acinetobacte rcalcoaceticus) 、甲烷单胞菌属( Methanomonas) 、甲基芽孢杆菌属( Methyloba-cillus)
2、 、甲基单胞菌属( Methylomonas) 等。但绝大多数菌株发酵产率低,难以实现工业化。肺炎克雷伯氏菌( Klebsiella pneumoniae) 的 PQQ 合成牵涉 6个基因构成的基因簇( pqqABCDEF)。当前 PQQ的合成机制尚未完全说明,定向改造其代谢途径存在难度。 全局转录工程( gTME) 是用易错 PCR 对 RNA聚合酶的 亚基或其他转录元件进行突变,通过改变 亚基与启动子区域的亲和力,进而影响基因的转录程度。 亚基的突变文库能结合大量启动子,可在转录组水平上大范围地影响基因转录,进而导致细胞代谢流量再分配,是一种全新的分子育种策略。据报道 K. pneumon
3、iae 的 因子包括 rpoD、rpoE、rpoH、rpoN、rpoS 等,华而不实 rpoD 为首要因子。转录经过中,提高 RNA 聚合酶对启动子区域的亲和力,可加强转录的强度。本文基于 gTME 策略,通过易错 PCR 构建 rpoD 基因的突变库,与载体连接后电转化 K. pneumonia DSM2026 构建突变菌株,从大量重组子中挑选 PQQ 高产菌。 1、 材料与方式方法 1. 1 材料 1. 1. 1 菌株与载体 肺炎克雷伯氏菌( K. pneumonia DSM 2026) 及表示出载体 pET-PK 由本实验室保存和构建,华而不实PK 代表甘油脱水酶基因 ( GenBank
4、 U30903 ) 本身的启动子。肺炎克雷柏氏菌 PQQ 基因簇示意图如此图 1。 1. 1. 2 培养基与试剂 LB 液体培养基( g / L) : 蛋白胨 10,酵母提取物5,氯化钠 10,pH 7. 0。LB 固体培养基需参加 1. 5%的琼脂。发酵培养基: 5 M9 盐溶液 200 mL,1 mol/L MgSO42 mL,20% 葡萄糖 20 mL,1 mol / L CaCl20. 1mL,加灭菌的去离子水至 1000 mL。5 M9 盐溶液( g/L) : Na2HPO4 7H2O 64,KHPO415,NaCl 2. 5,NH4Cl 5. 0。NBT-Gly 溶液: 20 mm
5、ol / L 磷酸盐缓冲液 PBS( 0. 2mol/L Na2HPO4,0. 2mol/L NaH2PO4,pH 7. 0) ,NBT-GlyK+溶液( 预先配制 2 mol/L Gly-KOH 溶液,pH 10) ,使用时参加氯化硝基四氮唑蓝( NBT) ,终浓度为 0. 24 mmol/L。 1. 2 实验方式方法 1. 2. 1 扩增目的基因 rpoD 在 NCBI 查得 K. pneumoniae 的 rpoD 基因序列( GenBankACI07699) ,设计引物,以 K. pneumoniae基因组为模板,进行 PCR,扩增 rpoD 基因。上游引物的酶切位点为 EcoR I,
6、下游引物的酶切位点为 SalI,下划线序列为引入的酶切位点。 1. 2. 2 转化重组质粒 将切胶回收的 rpoD 基因和 pET-PK 表示出质粒用EcoR I 和 Sal I 于 37 下酶解 2 h,用 T4 DNA 连接酶 16 连接过夜,构建对照组 rpoD 的重组质粒pET-PK-drpoD。将该重组质粒电转化感受态的 K.pneumonia DSM2026,复苏后涂布于含卡那霉素的LB 固体培养基,37 培养过夜。挑取单菌落进行菌落 PCR 和质粒双酶切鉴定。阳性克隆命名为 K. p( pET-PK-drpoD) ,华而不实 drpoD 意指未进行突变的 rpoD基因。 1. 2
7、. 3 构建突变库 以 rpoD 基由于模板进行易错 PCR,反响体系25 L: Taq DNA 聚合酶缓冲液 2 L,上下游引物均为0. 5 L,模板 0. 5 L,dATP 和 dGTP 0. 2 mmol / L,dCTP 和 dTTP 0. 6 1 mmol / L,Mg2 +2 4 mmol / L,rTaq DNA 聚合酶 0. 4 L。易错 PCR 反响参数为 95 3 min,94 1 min,55 50 s,72 2 min,进行 30个循环; 72 10 min,16 保存。用 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。 将切胶回收突变 rpoD 基因和表示出质粒 pET-P
8、K用 EcoR I 和 Sal I 于 37 下酶解 2 h,T4 DNA 连接酶连接过夜,构建重组突变质粒 pET-PK-trpoD,得到突变文库,华而不实 trpoD 意指突变的 rpoD 基因。 1. 2. 4 转化重组突变质粒及挑选阳性克隆 将重组突变质粒 pET-PK-trpoD 电转化感受态的 K. pneumoniae DSM2026,复苏后涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基,37 培养过夜,挑取单菌落进行菌落 PCR 鉴定。 1. 2. 5 重组菌发酵 对照菌 K. p ( pET-PK-drpoD) 及重组菌 K. p( pET-PK-trpoD) 进行24h 摇瓶发酵,设
9、置3 组平行,每隔 3 h 取发酵液,测定吸光度,绘制生物量曲线。 1. 3 分析方式方法 采用 NBT-Gly 法定性检测 PQQ。300 L 反响体系包括20 L PQQ 发酵液,80 L PBS,180 L Gly-KOH,20 L NBT,30 避光反响 1 h。吸打混匀后参加到 96 孔酶标板,以去离子水代替发酵液作对照,在波长 530 nm 下测吸光度 A,PQQ 产量与 A 值成正比。提取重组菌 K. p( pET-PK-trpoD) 的质粒进行测序。 2、 结果与讨论 2. 1 对照菌 K. p( pET-PK-drpoD) 的构建 以 K. pneumoniae 基因组为模板
10、 PCR 扩增 rpoD基因,如此图 2 所示,在 2000 bp 左右出现条带,与GenBank 颁布的 rpoD 基因( 1842 bp) 相符。将重组质粒 pET-PK-drpoD 电转化至感受态 K. pneumoniaeDSM2026,涂布平板培养后挑取单菌落进行培养,提取质粒进行双酶切鉴定,得到质粒 pET-PK ( 约5400bp) 和 rpoD 基因条带 ( 约 1800 bp) ,证明重组质粒pET-PK-drpoD 成功转化到 K. pneumoniae DSM2026中。 2. 2 突变库的构建 以 rpoD 基由于模板,进行易错 PCR 反响。如此图 3 所示,泳道 1
11、 10 所含 dCTP 和 dTTP 浓度相等,华而不实泳道 1、4、7、10 浓度为 1 mmol/L,泳道 2、5、8 浓度为 0. 8 mmol / L,泳道 3、6、9 浓度为 0. 6 mmol /L。除此之外泳道 1 3 Mg2 +浓度为4mmol/L,泳道4 6Mg2 +浓度为 3 mmol/L,泳道 7 10 Mg2 +浓度为 2mmol / L。从产量上看,以泳道 3 的条件为最优。用大体系( 100 L) ,最佳条件进行易错 PCR 反响,切胶回收 PCR 产物,纯化后的突变 rpoD 基因和 pET-PK 表示出质粒用 EcoR I 和 Sal I 于 37 下酶解 2
12、h,T4DNA 连接酶 16 连接过夜,构建重组突变质粒pET-PK-trpoD。将重组突变质粒 pET-PK-trpoD 电转化 K. pneumoniae DSM2026,得到突变文库。 2. 3 重组菌阳性克隆的挑选 将突变质粒 pET-PK-trpoD 电转化到感受态的K. pneumoniae DSM2026,涂布培养,挑取单菌落进行菌落 PCR 鉴定( 图 4) ,电泳显示大约 1800 bp 处有条带,证明重组突变质粒 pET-PK-trpoD 已转化至K. pneumoniae DSM2026 中。 2. 4 重组菌发酵生产 PQQ 重组菌 K. p( pET-PK-trpoD
13、) 的生物量曲线如此图5 所示。在对数生长期其生长速度和生物量明显快于对照菌 K. p( pET-PK-drpoD) ,发酵3h 后进入平稳期,表示清楚发生突变的 rpoD 影响了相关基因的表示出,有利于细胞生长和代谢; 进入平稳期后重组菌生长速度和生长量与对照菌基本持平,揣测是对数生长期 PQQ 的过表示出消耗了大量葡萄糖,进而无法维持菌体的对数生长。 重组菌 K. p( pET-PK-trpoD) 的 PQQ 产量如此图 6所示。从第 3 h 开场重组菌的 PQQ 高于对照菌,且其最高产量到达 76 mg/mL,比对照菌提高了约10% 。这是由于 rpoD 基因的突变扰动了胞内基因的转录,
14、代谢流发生重排,强化了 PQQ 的合成途径。由于辅酶与酶蛋白之间存在严谨的依存关系,微量辅因子即能极大扰动整个细胞代谢,因而 PQQ 远不可能到达乙醇和乳酸那样的产量。 将突变 rpoD 基因测序结果与 GenBank 中的rpoD 基因序列进行 Clustal W2 程序比对,发现 1842个碱基中的突变碱基为 46 个,无碱基缺失现象。翻译出的氨基酸残基中有 3 个发生了突变,分别为D200E、E332G、T569A,突变率为 0. 5% ,如此图 7。 用 SOPMA 在线程序( http: expasy. ch/tools) 对突变后 rpoD 蛋白质的二级构造进行预测并与突变前相比,
15、发现突变前 螺旋、伸展链、 转角和无规则卷曲的数目分别为 424、31、31、127,突变后的相应数目分别为 418、38、31、126,可见突变的 3个氨基酸残基对 二级构造产生了较大影响,进而影响了 RNA 聚合酶对启动子的亲和力。 3、 结论 用易错 PCR 构建了 K. pneumoniae 的 rpoD 基因突变文库,与载体连接后转化 K. pneumoniae,从约1500 株阳性克隆中挑选了一株 PQQ 生产菌,其产量比对照菌增长了 10%。测序发现其核酸和蛋白水平的突变率分别为 2. 5% 和 0. 5%。二级构造预测发现其 螺旋、伸展链、 转角和无规则卷曲的数目均发生了变化,揣测因而影响了 因子与启动子的辨别与结合,进而导致转录变化和代谢流量再分配。