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1、核酸疫苗制备卵黄免疫球蛋白的特点与应用,免疫学论文核酸疫苗 nucleic acid vaccine 是一种新型的基因工程疫苗，它将含有编码一种或几种抗原蛋白基因序列的重组质粒导入机体的细胞内，然后在宿主细胞内转录表示出抗原蛋白，诱导机体生成相应的细胞免疫应答与体液免疫，接种的机体因而得到了其提供的免疫保卫，能够有效防病治病。由于其良好的免疫原性、安全性、制备工艺简单等特点，核酸疫苗越来越遭到人们的重视。卵黄内含有一种免疫球蛋白，称之为卵黄免疫球蛋白 yolk immunoglobu-lin,IgY ,是家禽血液内的 IgG 经受体介导转移进入卵黄内构成，能够为新生个体提供防护。相对于哺乳动物
2、的 IgG,IgY 的构造特殊，且生物性能稳定，对一些疾病防护作用更好，因而被以为是一种新生代抗体。用核酸疫苗制备特异性 IgY,是将核酸疫苗技术和 IgY 技术优点结合起来。本文就核酸疫苗制备 IgY 的特点以及其应用现在状况进行了综述。 1 核酸疫苗 核酸疫苗包括 DNA 疫苗、RNA 疫苗和病毒载体疫苗三类1,是指将外源目的基因片段构建在质粒载体中，将其直接导入宿主体内，通过宿主细胞表示出目的蛋白，进而对机体产生刺激，机体遭到刺激后构成特异性免疫学反响，能够用于疾病的防治。核酸疫苗在疾病防治中特点主要具体表现出在 4 个方面： 与重组蛋白相比，抗原蛋白以天然构造呈递给宿主免疫辨别系统，诱
3、导机体产生特异性抗体，解决了体外制备抗原蛋白的改变或丢失问题2.核酸疫苗能够在寄宿机体内部持续表示出抗原蛋白，进而对机体产生刺激，构成持久性的免疫反响，免疫剂量也得以减少，降低了生产成本。可同时诱导体液免疫和细胞免疫反响，使宿主产生比使用大部分传统疫苗更有效的免疫应答。核酸疫苗研发周期短，生产成本低，且便于贮藏，在实际生产中具有优势3. 固然核酸疫苗的优点诸多，但不可否认其也存在着一些缺陷。表现为： 质粒导入细胞效率不高，产生的免疫水平偏低。已经有很多研究试图通过新的技术和方式方法如电穿孔法4 -5，选择适宜的佐剂6等以提高免疫效果。核酸疫苗的应用仍然存在着安全风险，尚未得到一致认可。固然应用
4、至今，还没有出现核酸疫苗导致基因整合的案例，但是质粒DNA 低水平整合到宿主基因组内有发生的可能性，进而导致发生诸如细胞癌变、基因紊乱、细胞转型的严重后果。所以，目的基因表示出的可控性、核酸疫苗的安全性等问题亟需得到妥善处理。 2 IgY 的分子特性 IgY 是通过特异性受体介导并转移富集于卵黄中的多克隆抗体。IgY 包含 2 条轻链 2L 和 2 条重链 2H ,轻链和重链通过二硫键相连接，轻链由一个可变区和一个恒定区组成，而重链是由一个可变区和四个恒定区组成7.IgY 相对分子质量为 180 103,等电点在 pH 5. 7 7. 6 之间。和哺乳动物IgG 相比，IgY 缺少铰链构造，因
5、而比后者愈加稳定。 IgY 性能稳定，IgY 在 60 65 加热活性不会明显下降，但在 70 加热仅 15 min 活性就会迅速降低。有研究表示清楚，在缓冲体系中添加糖类能够提高 IgY 热稳定性8.IgY 在 pH 4. 0 11. 0 时稳定，在 pH 3. 5 时活性迅速下降，pH 3. 0 时几乎完全失去活性。类似地，在缓冲体系中添加糖类、多元醇等稳定剂能够显着提高 IgY pH 耐受性9.除此之外，IgY 对胃蛋白酶具有较高的抵抗力，并且可黏附于细菌鞭毛上，使细菌不能黏附于肠道黏膜上皮细胞10,提示 IgY 能够用于胃肠细菌感染的预防和治疗。幽门螺杆菌与慢性胃炎、消化性溃疡和胃黏膜
6、相关组织淋巴瘤 MALT 的发生密切相关，夏丽君等11用 HpaA-VacA IgY 通过灌胃方式对 BALB/c小鼠胃黏膜幽门螺杆菌感染模型预防作用的研究，发现口服 HpaA-VacA IgY 能有效预防幽门螺杆菌感染引起的胃黏膜炎症反响。Mulevy 等12通过仓鼠困难梭菌感染模型研究发现高浓度特异性 IgY 治疗能够降低困难梭菌引起的急慢性结肠炎的发生率。 由于抗生素的滥用，治疗金黄色葡萄球菌引起的感染面临宏大的挑战，彭维等13通过体外抑菌实验发现抗金黄色葡萄球菌 IgY 能抑制其生长活性，抑菌率到达 93. 5%.表示清楚 IgY 有望代替抗生素用于细菌感染性疾病的治疗，避免菌群失调和
7、耐药性的产生。 3 核酸疫苗制备 IgY 核酸疫苗制备抗体作为一种新的免疫手段具有宏大的商业价值，它能够针对编码不同抗原蛋白产生特异性抗体。然而，在实际生产中，用核酸疫苗免疫的小鼠抗体产量很低，这成为了用核酸疫苗制备抗体的主要局限14.除此之外，鼠源性抗体在临床治疗中可诱发人抗鼠抗体 human anti-mouse antibody,HAMA 而导致不良反响，而且其不能有效地激活人体的生物效应，半衰期短，因此并不适用于人类的免疫治疗15. 核酸疫苗制备 IgY 妥善处理了上面所述的各种问题，表现出明显的优势，表如今： 免疫反响的诱导不需要通过对蛋白抗原的提纯来实现。蛋白抗原能够在细胞内部的原
8、位表示出实现，进而诱导免疫反响，于宿主体内构成抗体16.与传统抗体生产经过相比，这种方式方法能够妥善处理好耗时费力的抗原蛋白提纯的前期准备，除此之外还能够有效防止由于蛋白提纯不完全导致产生潜在污染的问题。 生成的抗体质量水平。由于鸟类与哺乳动物种系发生学的距离远，鸟类对来自哺乳动物的抗原能够产生强烈的免疫应答反响，因而构成的抗体的亲和力与反响活性都非常好17.这种方式方法产生的抗体蛋白，经过合成与翻译后修饰经过可得到与其天然存在形式特别相近的构象18.而且 IgY 不能激活哺乳动物的补体系统，不与哺乳动物的 Fc 受体、类风湿因子、葡萄球菌蛋白 A、葡萄球菌蛋白 G 结合19,集高特异性和高灵
9、敏性于一体，在免疫诊断中具有明显的优势。 抗体的生产工艺简单，生产效率高。卵黄中的主要成分是水、蛋白质和脂类，IgY 的分离纯化多采用水稀释法联合盐沉淀法7.IgY 能够大量聚集在卵黄内部，只需要一个卵黄就能够制得 60 100 mgIgY,因而每只鸡或者鸭都能够看做一个生产抗体的小工厂20.非侵入性手段制备。IgY 是通过提取免疫动物所产蛋的卵黄而获得，无需采血、无损伤，避免了采血给动物带来的痛苦。欧洲替代方式方法验证中心 ECVAM 建议以 IgY 代替哺乳动物 IgG作为实验和生产抗体的来源21.通过该技术建立了一座连接基因序列与其所编码蛋白质的功能和生物学特性之间的桥梁，人们能够通过此
10、技术获得后基因组时代所需的各种抗体。 4 应用现在状况 IgY 抗体应用范围特别广泛，能够将其运用至被动免疫治疗之中，研究型的诊断策略，划分新发现的基因所编码的新型蛋白质的类型。 研究表示清楚，用可表示出产生幽门螺杆菌尿素酶 B亚基 UreB 的质粒免疫产蛋阶段的鸭，在这里之后能够发现，鸭蛋的卵黄内产生了抗 UreB 的 IgY 抗体22.将其抗体运用到慢性幽门螺杆菌感染的治疗中能够获得很好的治疗效果。 在水产动物疾病治疗方面，Lu 等23用编码对虾白 斑综合征病毒 white spot syndrome virus,WSSV 囊膜蛋白 Vp19 和 Vp28 及核衣壳蛋白 Vp15的融合基因
11、 DNA 疫苗免疫蛋鸡制得高抗 WSSV 活性 IgY 抗体，随即用 DNA 疫苗为抗原制备的 IgY 和病毒体外中和液注射对虾及鳌虾后观察死亡率，表示清楚对 WSSV 具有很好的中和作用，延缓感染 WSSV虾体的死亡，降低其死亡率。同时发现用含 CpG 佐剂的 DNA 疫苗免疫组其抗体活性长时间持续在中等水平，免疫后 110d,未见明显降低。受此研究启发，Witkowski 等24用痘病毒 p28 或 f1l 基因保守序列构建的 DNA 疫苗用基因枪注射法免疫蛋鸡获得了高滴度的特异性 IgY 抗体，免疫后 120 d 同样未见明显降低，提示抗原蛋白在体内持续表示出。 Abouzid 等25同
12、样用这种方式方法制得了乙肝外表抗原 HBsAg 变异株特异性 IgY 抗体。由于 HBsAg易变异，导致现有的临床检测试剂盒并不能检出，而用 HBsAg 变异株特异性 IgY 抗体能够用于乙型肝炎病毒 hepatitis B virus,HBV 变异株的免疫诊断，讲明核酸疫苗制备 IgY 抗体在临床诊断领域具有广阔的市场空间。 5 小结与瞻望 近些年来，随着基因组学和蛋白质组学的迅猛发展，抗体在科学研究和临床应用中占据了特别重要的地位，对抗体量的需求日益增加，低成本大规模的抗体制备正逐步成为新的研究热门。传统的抗体制备方式方法是用大剂量高纯度的抗原蛋白免疫动物，然而抗原蛋白的制备存在多种缺陷： 在细菌中的弱表示出、多以包容体形式存在和纯化回收率低等。除此之外，还存在与杂蛋白共免疫时产生的特异性较差等问题。核酸疫苗制备 IgY 克制了上述问题，具有成本低廉，合适大规模生产，独特的抗体优势等特点，有望成为大规模制备抗体的有效手段，推进抗体的研究与发展。