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1、图示固定相CaCO3颗粒流动相石油醚 色带色带第1页/共124页1941年，英国人Martin和Synge首次提出液液色谱法20世纪40年代，在研究分配色谱理论的过程中，证实了气体作为色谱流动相的可行性，并预言了GC的诞生。1952年他们发表第一篇关于GC的论文。获1952年的若贝尔化学奖。1955年，第一台商品GC仪器推出。第2页/共124页1956年，Martin首次提出使用小口径（0.2mm）色谱柱的建议1957年，美国学者Golay首先用毛细管进行色谱分离实验，获得了高于填充柱的分辨率和柱效能1959年，Porath和Flodin提出空间排阻色谱1970年以后逐渐发展了HPLC以及各种
2、检测器和联用手段1975年，Small发表第一篇离子色谱论文，同年商品仪器问世1979年，弹性石英毛细管色谱柱商品化第3页/共124页1按两相分子的聚集状态分：流动相 固定相 类型液相色谱液相色谱液液体体 固固体体 液液-固固色色谱谱液液体体 液液体体 液液-液液色色谱谱气体气体 固体固体 气气-固色固色谱谱气气体体 液液体体 气气-液液色色谱谱气相色谱气相色谱第二节 色谱法的分类第4页/共124页续前 2按操作方式分：平面色谱 纸色谱 薄层色谱 高分子薄膜色谱柱色谱 填充柱色谱毛细管柱色谱 第5页/共124页3按分离机制分：分配色谱法分配色谱法 吸附色谱法吸附色谱法 离子交换色谱法离子交换色
3、谱法 空间排阻色谱法空间排阻色谱法 亲合色谱法亲合色谱法 化学键合相色普法化学键合相色普法 毛细管电色谱法毛细管电色谱法 毛细管电泳法毛细管电泳法第6页/共124页图示色谱法简单分类第7页/共124页第三节第三节 色谱法的特点与局限性色谱法的特点与局限性一、色谱法的特点1.选择性好2.分离效率高，分析速度快3.灵敏度高，样品用量少4.应用范围广第8页/共124页二、色谱法的局限性二、色谱法的局限性1 1.色谱法本身不能够直接定性，需要用已知标准物质或将数据与标准数据对比，或与其他方法联用，如质谱，红外才能获得较可靠的结果；2.定量测定时需要用标准物质对检测器信号进行修正；3.对某些异构体，固体
4、物质的分析能力较差。第9页/共124页第四节 色谱现代发展及联用技术1.新型固定相和检测器的研制2.色谱新方法的研究3.色谱联用技术4.色谱专家系统第10页/共124页有关色谱的工具书及色谱期刊张祥民编著.现代色谱分析，2006年3月第1版，复旦大学出版社苏立强主编.色谱分析法，2009年第1版，清华大学出版社刘虎威编著.气相色谱方法及应用，2007年5月第2版，化学工业出版社傅若农主编.色谱技术丛书，2007年5月第2版，化学工业出版社第11页/共124页分析化学色谱分析测试通报药物分析杂志分析试验室分析科学学报JournalofChromatographyA/BJournalofChrom
5、atographicScienceJournalofSeparationScienceChromatographiaJournalofLiquidChromatography&RelatedTechniquesBiomedicalChromatographyLC-GCJournalofCapillaryElectrophoresisElectrophoresisAnalyticalChemistry第12页/共124页 第二章 色谱基本理论定性参数定量参数柱效参数分离参数相平衡参数第一节 色谱参数 第13页/共124页续前（一）色谱流出曲线和色谱峰1色谱流出曲线是由检测器输出的电信号强度对时间
6、作图所绘制的曲线，又称为色谱图(Chromatogram)。2基线(Baseline)是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。一、色谱流出曲线和有关概念 第14页/共124页色谱图示意图色谱图示意图第15页/共124页3色谱峰(Peak)是流出曲线上的突起部分。正常色谱峰为对称形正态分布曲线。不正常色谱峰有两种：拖尾峰(TailingPeak)和前延峰(LeadingPeak)。色谱峰的对称与否可用对称因子fs(symmetryfactor)，或叫拖尾因子(tailingfactor)，来衡量。对称因子在0.951.05之间的色谱峰为对称峰；第16页/共124页小于小于0.950.95者为前
7、延者为前延峰峰大于大于1.051.05者为拖尾者为拖尾峰峰。第17页/共124页从色谱图中，可得许多信息：1 色谱峰的个数，可判断所含组分的最少个数；2 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；3 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；4 色谱峰的保留值及其区域宽度，评价柱效依据；5 色谱峰两峰间的距离 第18页/共124页二、定性参数（一）保留值（一）保留值1保留时间(retentiontime；tR)是从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔，即从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。2死时间(dead time；t0)是分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间
8、第19页/共124页第20页/共124页3调整保留时间(adjustedretentiontime；)n n4 4保留体积保留体积(retention volume(retention volume；V VRR)是从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。第21页/共124页5死体积(deadvolume；V0)第22页/共124页6调整保留体积(adjustedretentionvolume；)与流动相流速无关与流动相流速无关7相对保留值(relativeretention；r)第23页/共124页8保留指数(retentionindex；I)又称Kovats指数
9、，定义式如下：I Ix x-待测组分的保留指数待测组分的保留指数z z与与z+nz+n-正构烷烃对的碳原子数正构烷烃对的碳原子数n n可为可为1 1、2 2，通常为，通常为1 1。第24页/共124页规定正己烷、正庚烷、正辛烷的保留指数分别为600、700、800，依次类推。同系物中，每增加1个CH2，保留指数增加100。例如在阿皮松柱上，测定某样品的保留指数，测得数据如下：第25页/共124页tRt0样品乙酸正丁酯340s30s物质对正庚烷(Z)204s正辛烷(Z+n)403.4s说明乙酸正丁酯的保留行为，相当于7.756个碳的正构烷烃的保留行为。第26页/共124页三、柱效参数（一）色谱峰
10、区域宽度1标准差(standard deviation；)是正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半。是正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半。越大，组分越分散；反之越集中。越大，组分越分散；反之越集中。第27页/共124页第28页/共124页2半峰宽(peakwidthathalfheight；W1/2)是峰高一半处的峰宽。W1/2=2.3553峰宽(peakwidth；W)是通过色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。W=4或 W=1.699W1/2第29页/共124页（二）理论塔板数和理论塔板高度1.理论塔板数第30页/共124页第31页/共124页2.理论塔板高度第32页/共124页四、分离参
11、数若R=1，4分离，两峰基本分开。若R=1.5，6分离，两峰完全分开(基 线分离)。第33页/共124页2.基本分离方程式（1）柱色谱第34页/共124页a项取决于柱效，n，a项b、c项相关在GC中：b项主要受色谱柱性质影响c项主要受柱温影响在HPLC中：b项主要取决于流动相的种类c项主要取决于流动相的配比第35页/共124页（2）薄层色谱：讨论：a项为薄层板板效项。N，斑点越集中，R。b项为选择项。选择合适的流动相，提高。c项为容量项。Rf2，R。最佳分离条件：Rf值在0.30.5。调整展开剂极性，使Rf值落入最佳范围。第36页/共124页（二）有效峰数（effective peak num
12、ber,ENP)ENP的含义：在含有Z与Z+1个碳的正构同系物的色谱峰间能容纳的色谱峰数。ENP越大，色谱柱的分离性能越好。第37页/共124页例如：在一个20m0.24mm内径的WCOT柱，固定液为Carbowax20M，柱温80，测定正构醇同系物得：正戊醇、正己醇和正庚醇的保留时间分别为：554.0，870.6和1459.2s，色谱峰宽分别为：7.54，12.03和20.40s。用正戊醇、正己醇的数据计算ENP第38页/共124页（三）分离值1.分离值在柱色谱中的定义和含义第39页/共124页例1若RZ+1/Z=6，R*1.5，则SV=3.说明在含有Z与Z+1个碳的同系物的色谱峰间能容纳3
13、个色谱峰。例2若RZ+1/Z=6，R*1.0，则SV=5.说明在含有Z与Z+1个碳的同系物的色谱峰间能容纳5个色谱峰。第40页/共124页第41页/共124页2.在薄层色谱法中的定义和含义R-Rf=0和Rf1两组分斑点的分离度R*-相邻两组分斑点的分离度SV的含义：在Rf=0和Rf1两组分斑点间能容纳分离度R*的相邻组分的斑点数。第42页/共124页例1 若Rf=0及Rf1两组分斑点分离度R=6，两相邻组分斑点的R*=1.5,则：说明在薄层板上Rf=0及Rf1两组分斑点间能容纳R*=1.5的斑点3个。第43页/共124页例2 若Rf=0及Rf1两组分斑点分离度R=6，两相邻组分斑点的R*=1.
14、0,则：说明在薄层板上Rf=0及Rf1两组分斑点间能容纳R*=1.0的斑点5个。第44页/共124页SV的数值取决于R和R*，无统一规定，所以不便于比较，所以，常用分离数（SN或TZ）衡量色谱柱和薄层的分离性能。第45页/共124页（四）分离数（separation number,SN;Trennzahl,TZ)在柱色谱法中的定义和含义第46页/共124页第47页/共124页将分离度公式代入上式：第48页/共124页分离数的含义：当相邻峰的分离度（R*)为1.177时，在含有Z与Z+1个碳同系物间能容纳的色谱峰数。用例1中的正戊醇与正己醇的数据计算SN得：第49页/共124页计算结果表明，该W
15、COT柱在正戊醇与正己醇间可容纳相邻峰分离度为1.177得色谱峰26.5个。第50页/共124页2.在薄层色谱法中的定义和含义第51页/共124页在薄层色谱法中，计算Rf=0及Rf=1两组分斑点的分离度时，可用下式：第52页/共124页SN的含义：在相邻斑点的分离度为1.177时，在Rf=1及Rf=0两组分斑点间能容纳的斑点数。第53页/共124页计算结果表明，在Rf=1及Rf=0的组分的斑点间，可容纳相邻斑点的分离度（R*)为1.5得斑点9.5个。例用硅胶板，在一定的分离条件下，得以下数据：L=127mm，Rf=0物质的b0=3.9mm，Rf=1物质的b1=8.2mm，计算SN=?第54页/
16、共124页五、相平衡参数(一)分配系数1.分 配 系 数 与 线 性 色 谱(distributioncoefficient；K)组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(C)之比。第55页/共124页分配系数与组分浓度大小无关，其色谱峰呈正态分布-线性色谱。非线性色谱体系的K不是常数，K随浓度而变化。分配系数由组分和固定相的热力学性质决定，随柱温而变化，与两相体积无关。在液相色谱法中，还决定于流动相的性质。第56页/共124页2.分配系数与柱温的关系Go-相对于标准状态的组分自由能R-气体常数Tc-柱温一般，温度上升20，K值约下降一半。第57页/共124页3容量因子(capacityfac
17、tor；k)组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。容量因子又称为质量分配系数或分配比。容量因子又称为质量分配系数或分配比。第58页/共124页Vm-色谱柱中流动相的体积，近似等于死体积V0Vs-柱中固定相的体积第59页/共124页(二)分配系数和容量因子与保留时间的关系设流动相的线速度为u，组分的速度为v，将二者之比称为保留比：4分配系数和容量因子的关系第60页/共124页在定距展开如柱色谱中，v=L/tR，u=L/t0，因此第61页/共124页第62页/共124页第63页/共124页（三）分配系数与保留体积的关系第64页/共124页（四）分配系数与比移值的关系第65页/共124页（五）容量
18、因子与比移值的关系第66页/共124页例1组分A在柱内的移动速度只有流动相速度的1/10，柱内液体流动相体积为2.0ml，固定相体积为0.5ml。求流动相流量为10ml/min时，组分A停留在固定相中的时间和它的分配系数。第67页/共124页R=1/1+k=0.1k=9VR=Vm(1+k)=2.0（1+9）=20mltR=VR/F0=20/10=2.0mint0=tR/1+k=2.0/1+9=0.2min第68页/共124页组分停留在固定相中的时间为：第69页/共124页例2组分A和B分别在15.0min和25.0min洗脱出柱，而非滞留组分只需2.0min。求：1）B对A的相对保留时间2）A
19、的容量因子3）A滞留在流动相中的时间分数第70页/共124页A滞留在流动相中的时间分数，即为保留比第71页/共124页六、色谱分离的前提第72页/共124页两式相减得：第73页/共124页第二节 塔板理论 塔板理论假定：在色谱柱内一小段长度H内，组分可以在两相中瞬间达到分配平衡。H称为理论塔板高度。色谱是一种分离技术,组分先分离才可定性定量.如何选择最佳分离条件,这需要色谱理论的指导.第74页/共124页流动相进入色谱柱不是连续的，而是间歇式的，每次进入一个塔板体积。试样和新鲜流动相都加在第0号塔板上，且试样的纵向扩散可以忽略。分配系数在各塔板上是常数。第75页/共124页一、二项式分布假设：
20、分离含有2个组分的混合物K=Cs/Cm=2Vs=Vm试样溶液100%加到零号塔板上上层（流动相溶质含量）：mm下层（固定相溶质含量）：ms mm+ms=1第76页/共124页经过N次转移后，在各塔板内组分的质量分布符合二项式的展开式：（mm+ms)N=1N=3，K=2时，mm=0.333，ms=0.667，各塔板内溶质的含量为：（0.667+0.333)3=0.297+0.444+0.222+0.037（0号）（1号）（2号）（3号）第77页/共124页第78页/共124页转移N次后第r号塔板中的质量Nmr 例如，N=3，r=3时，即转移3次后，在第3号塔板内的溶质分数为：第79页/共124页
21、二项式展开式各项相当于各塔板中某一个组分溶质的总量组分在流动相中的含量应为：第80页/共124页第81页/共124页组分在固定相中的含量应为：第82页/共124页当 n=3,r=0时,求流动相和固定相中溶质的含量第83页/共124页二、正态分布-标准差 tR-保留时间C0为峰面积A，即相当于某组分的总量 C-任意时间t时的浓度 色谱流出曲线方程式:第84页/共124页 (1)t=tR时，有极大值,Cmax即流出曲线的峰高，也可用h表示。将h及W1/2=2.355代入上式，得峰面积C0或A：A=1.065W1/2h讨论第85页/共124页将式(2)代入式(1)得：不论 t tR或 t tR时，浓
22、度C恒小于Cmax。C随时间t向峰两侧对称下降。第86页/共124页Cmax的影响因素 (1)进样量C0愈大,则Cmax愈大.C0与Cmax成正比。这是色谱峰高定量的依据。（2）H值愈小，柱效愈高，愈小,Cmax/C0比值愈大。即H越小，柱效n越高 (3)色谱柱内径愈小，填充愈紧密，Cmax/C0比值也愈大。即柱愈细填充愈紧密，柱效n越高。（4）色谱柱愈短，Cmax值愈大。（5）先流出柱子的组分容量因子小，所以Cmax/C0比值愈大，反之提高色谱柱的温度（对GC），增加流动相中强洗脱溶剂的浓度（对HPLC），都可以使容量因子下降，比而使Cmax/C0比值愈大，提高色谱检测灵敏度。第87页/共1
23、24页三、理论塔板高度和理论塔板数第88页/共124页 H=L/n如果用代替tR，为有效塔板数：理论塔板高度为：第89页/共124页例1在柱长2m、5%阿皮松柱、柱温100、记录纸速为2.0cm/min的实验条件下，测定苯的保留时间为1.50min，半峰宽为0.10cm。求理论塔板高度和每米的理论塔板数。第90页/共124页每 米 理 论 塔 板 数 为：2.4103/2=1.2103(m1)解第91页/共124页四、塔板理论的作用与不足四、塔板理论的作用与不足(一)塔扳理论在色谱法中的地位与作用：1从塔板理论方程式的形式看它描述的色谱信号轨迹应该是正态分布函数，与实际记录的色谱流出曲线相符合
24、，说明此方程是准确的，且对色谱分配系统有理论指导意义。2由塔板理论据导出来计算往效率的理论塔板数(n)公式，是行之有效的。长期以来用n值的大小评价色谱柱柱效是成功的，是色谱工作者不可缺少的计算公式。第92页/共124页3.塔板理论方程式描述色谱峰极高点的Cmax数值是符合公式要求的，实验数据证明Cmax 与n，Co，VR之间的关系是正确的。各参数对Cmax之影响都是客观的。4按塔板理论模型所建立起来的一些方程式讨论了某些色谱参数对组分色谱峰区域半峰宽公式均符台流出曲线半高峰宽变化的实际。特别应指出的是，塔板理论也提出了理论塔板高度对色谱峰区域宽度扩张的影响，这一点过去往往被忽视。第93页/共1
25、24页(二)塔扳理论存在的不足：1.塔板理论是模拟在一些假设条件下而提出的，假设同实际情况有差距，所以他描述的色谱分配过程定量关系合有不准确的地方。2.对于塔板高度H这个抽象的物理量究竟由哪些参变量决定的？H又将怎样影响色谱峰扩张等一些实质性的较深入的问题，塔板理论却不能回答。第94页/共124页3.为什么流动相线速度(U)不同，柱效率(n)不同；而有时当U值由很小一下变得很大时，则柱效能（n）指标并未变化许多，但峰宽各异，这些现象塔板理论也无能为力4.塔报理论忽略了组分分子在柱中塔板间的纵向扩散作用，特别当传质速率很快时，其纵向扩散作用为主导方面，这一关键问题并未阐述。第95页/共124页5
26、.5.塔板理论也未说明塔板理论也未说明变化对组变化对组分在柱内移动速率的影响。实际分在柱内移动速率的影响。实际上上V VL L、VGVG在某些方面决定着组分在某些方面决定着组分分子的扩散行为和扩散距离。分子的扩散行为和扩散距离。综上所述塔板理论虽为半经验理论，但在色谱学发展中起到了率先作用和对实际工作的指导作用，所以至今延用不衰，为广大色谱工作者承认。第96页/共124页塔板理论不足之处塔板理论不足之处不能解析载气流速U对N影响不能指出板高H受那些因素影响第97页/共124页第三节 速率理论一、气相色谱速率理论方程式 Van Deemter 方程式：H=A+B/u+Cu H-塔板高度 A-涡流
27、扩散系数 B-纵向扩散系数 C-传质阻抗系数 u-流动相的线速度(cm/s)第98页/共124页第99页/共124页塔板高度由A、B/u和Cu三项构成。在低线速（0u最佳之间）时，u越小，B/u项越大，Cu项越小。此时，Cu项可以忽略，B/u项起主导作用，u增加，H降低，柱效高。在高线速时（uu最佳），u越大，Cu项越大，B/u项越小，Cu项起主导作用。u增加，H增加，柱效降低。第100页/共124页（一）影响板高因素的讨论1涡流扩散(eddydiffusion)也称为多径扩散。A=2dp-填充不规则因子dp-填料(固定相)颗粒的平均直径第101页/共124页第102页/共124页2纵向扩散(
28、longitudinal diffusion)B=2 Dm-弯曲因子Dm-组分在流动相中的扩散系数 Dm与温度成正比，与相对分子质量的平方根成反比；纵向扩散与流动相的线速率成反比，所以使第103页/共124页用较高流速、降低柱温和采用相对分子质量较大的载气，都能减小分子扩散。载气线速度小时，用N2载气线速度大时，用H2第104页/共124页3传质阻抗 (mass transfer resistance)C=Cm+Cs第105页/共124页Cs-固定相传质阻抗系数k-容量因子df-固定液的液膜厚度Ds-溶质在固定相中的扩散系数第106页/共124页减少Cs的方法：（1）降低固定液液膜厚度（2）增
29、大Ds：柱温升高，Ds增大（3）k值对Ds的影响：第107页/共124页当k1时，k增大，Cs减小当k时，Cs0当k=1时，最大，柱效最低。此时，第108页/共124页（二）Van Deemeter方程式在GC中的表现形式1.填充柱（1）一般情况下，Cm可以忽略，CCsH=A+B/u+Csu 将A、B、Cs代入上式中，则：第109页/共124页（2）快速气相色谱法 H=A+B/u+Cmu+Csu若以单位柱长计算气相传质阻抗造成的峰展宽，则：第110页/共124页将Cm及Cs代入式（1）中得：2.开口毛细管柱第111页/共124页第112页/共124页二、液相色谱法速率理论（一）Giddings
30、液相色谱速率方程式Giddings与Snyder等人提出的液相色谱速率方程式：H=He+Hd+Hm+Hsm+Hs或：H=A+B/u+Cmu+Csmu+Csu第113页/共124页第114页/共124页第115页/共124页第116页/共124页讨论：1.流动相流速与板高的关系 H=A+Cu uH2.涡流扩散项A=2dp采用小粒度、球形固定相。常用310m的填料。匀浆法装柱。第117页/共124页3.传质阻抗系数在液相中，采用化学键合相，“固定液”只是在载体表面的一层单分子层，因此，在液相中的传质阻抗可以忽略。则：H=A+Cmu+Csmu第118页/共124页4.传质阻抗对板高的影响第119页/共124页Cm及Csm都与固定相的粒径平方dp2成正比，与扩散系数Dm成方比。因此，采用小粒度固定相及低粘度流动相。高柱温可以增大Dm，但是，有机溶剂为流动相时，容易产生气泡，因此，一般采用室温。第120页/共124页（二）柱外效应色谱峰展宽的总方差，等于柱内、柱外及其他独立因素的方差和：第121页/共124页2.柱外峰展宽（柱外效应，外）第122页/共124页第123页/共124页感谢您的观看！第124页/共124页