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1、Western Blot 基本原理、过程及注意事项 原理 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用 相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗 体检测。主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测。样品的准备 样品种类主要有培养的细胞、组织（需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿 瘤细胞）等。1、裂解液主要有 RIPA 和三去污两种，RIPA 适用于细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总蛋白。三去污又分为离子型和非离子型。离子型的 裂解能力较强如 SDS 等，非离子型的包括 NP-40、Tritonx-100。2、裂解液的成分，作用 试剂 增加离子强度 Nacl
2、pH Tris-盐酸缓冲液 裂解剂 SDS 溶剂 水 蛋白酶抑制剂 PMSF、Cocktail 等 磷酸酶抑制剂 Cocktail 等 3、样品缓冲液 sample buffer 作用 试剂 增加负电 SDS pH Tris 缓冲液 抗氧化 DTT 密度 甘油 指示剂 溴酚蓝 备注：1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。裂解完后样品液会显得粘稠是长结构 DNA 所致，故需要匀浆，打断 DNA。一般不用超声，因为容易引起蛋白不可逆的变性。2、用 2X 样品缓冲液与样品 1：1 混匀。4 度保存。1、样品混合液加样前需要 100或沸水浴加热 3-5 分钟并迅速插入冰 中，
3、以充分变性蛋白。配胶：胶的主要成分为丙烯酰胺和 N，N-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解 双丙稀酰胺)的去离子水配制含有 29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N-亚甲双丙 烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺 1g，加 H2O 至 100ml。)储于棕色瓶，4避光保存。4、分离胶的配方：以 20ml 的 8分离胶为例：H2O 9.3 ml 30Acrylamide 5.3 ml 1.5M Tris（PH8.8）5.0 ml 10X SDS 0.2 ml 10X 过硫酸胺(AP)0.2 ml TEMED 0.012ml 5、浓缩胶配方：6ml 为例 H2O 4.1
4、 ml 30Acrylamide 1.0 ml 1M Tris(PH6.8)0.75 ml 10X SDS 0.06 ml 10X 过硫酸胺(AP)0.06 ml TEMED 0.006 ml 备注：1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合，在蛋白质表观分子量 分析时影响大。2、因为有 SDS，每次混匀时 不应剧烈以免产生过多气泡。3、蛋白容易与 SDS 脱离而失去负电荷,因此胶中加入 SDS 为了给蛋白 持续的负电荷。4、垫条清洗干净，与制胶板压紧，避免漏胶。5、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面，其作用：可以平衡胶面，赶气 泡等。胶固定后用滤纸吸除干净，有水跑胶时条带会歪。6、先插梳子再灌浓
5、缩胶。溴酚蓝快跑出胶时停止。转膜 根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于 Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC)和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液 的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在 一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被 转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的 NC 膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用 0.45m 和 0.2m 两种规格的 NC 膜。大于 20kD 的蛋白可用 0.4
6、5m 的膜，小于 20kD 的蛋白就要用 0.2m 的膜了，如用 0.45m 的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF 膜灵敏度、分辨率和蛋 白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使 用之前必需用纯甲醇浸泡湿透。装配转移根据三明治原则：海绵层滤纸胶膜层滤纸海绵。膜应 先浸入纯甲醇湿透。每层放好后，加紧夹板。切记：将转移槽置于冰浴中，放入“三明治”（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，250mA，2h。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源 是否接通。转膜结束后，切断电源，取出蛋白膜。备注：1、整个过程保持膜的湿润不能干掉。干会产生气
7、泡。转膜时气泡处蛋白会 跑向旁边。2、膜入甲醇时斜而慢，避免产生气泡。3、转膜缓冲液一般不加 SDS，但大槽时因导电性差需加少量，加甲醇用于维 持膜与水的相亲性。4、由于甲醇易挥发，加入 15-20甲醇时应带盖混匀。5、三明治插到槽中时，槽中需要有液体。6、电流不能过高，高电流易产热，过热会使条带扩散。封闭 1用 25 ml TBS 洗膜 5min，室温，摇动。2置膜于 25 ml 封闭缓冲液中 1h,室温，摇动。备注：1、封闭缓冲液可用 0.5%牛血清白蛋白，但价贵。常用 5%脱脂奶粉。2、封闭的作用是结合膜上其他的活性位点，防止抗体与之结合。3、一般室温轻摇 1-2h，也可以 4 度过夜，或者 37 度 0.5h（一般背景会高）。免疫杂交与显色 115ml TBS/T 洗 3 次（5 min/T）。2加入合适稀释度的一抗，室温孵育 1-2h 或 4C 过夜，缓慢摇动。315 ml TBS/T 洗 3 次（5 min/T）。4加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育 1h，缓慢摇动。515 ml TBS/T 洗 3 次（5 min/T）。615 ml TBS 洗 1 次。7蛋白检测(显色法或发光法)。备注：1、稀释的抗体可用 5%的牛奶增加蛋白浓度。