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1、沙门氏菌、志贺氏菌和肠杆菌科噬菌体检验方法2004-02-04 13:28:09,86GB/T 4789.311994食品卫生微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆科噬菌体检验方法1主题内容与适用范围本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏菌、志贺氏 菌和致泻大肠埃希氏菌的基本要求、操作程序和结果判定。本标准适用于各种食品、食物中毒的检验，也适用于食品从业人员的肠 道沙门氏菌利志贺氏菌带菌检验。2引用标准GB 4789. 4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB 4789. 5食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验GB 4789.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验
2、GB 4789. 28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料3. 1 温箱：36lo4. 2水平仪。5. 3 灭菌平皿：90nlmX 15mm。6. 4定量滴管：每滴约IOhL。用输液用的玻璃接管配4. 5号针头， 灭菌。6.5 橡皮乳头。6.6 灭菌棉签。6.7 酒精灯。6.8 接种棒，锲络丝。6.9 试管架。4培养基和试剂4. 1营养琼脂、营养肉汤按GB 4789. 28中3. 7和3. 8进行。4. 2蛋白陈水、嵌基质试剂按GB 4789. 28中2. 13进行。7. 3三糖铁琼脂按GB 4789. 28中3. 24和3. 25进行。7.5 肠杆菌科诊断用噬菌体，7种和3种
3、。安甑启开后用无菌毛细吸 管吸出移入灭菌小试管内，用无菌胶塞塞紧，放于4c冰箱备用。5检验程序7.6 肠杆菌科诊断用噬菌体检验沙门氏菌的程序见图1：（表略）5. 2肠杆菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序见图2：（表略）8. 3肠杆菌科诊断用噬菌体检验致泻大肠埃希氏菌的程序见图3：（表略）6检验步骤8.5 前增菌、增菌和分离6. 1. 1沙门氏菌的前增菌、增菌和分离，按GB 4789. 4进行。7. 1.2志贺氏菌的增菌和分离,按GB 4789.5进行。9. 1.3致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离，按GB 4789. 6进行。10. 2噬菌体试验6.2. 1培养基的准备营养琼脂平板（含琼脂现1.5%
4、,琼脂量视其凝固性而定，约为一般用 量的3/4）,每个9cm平皿中约25mL,放在水平台面上俟其凝固，翻转平板, 在36半开皿倒置约lh,以烘干培养基表面水分，并使琼脂具有显著的吸 水性。试验菌液的准备从选择性鉴别平板上挑取菌落，一般应多挑几个菌落，以防遗漏。检验 沙门氏菌时，不但应挑取乳糖阴性产HB和不产HB的菌落，还应挑取乳糖 阳性产ILS的菌落。检验大肠埃希氏菌时应挑取乳糖阳性或阴性的菌落35 个。检验志贺氏菌时应挑取可疑菌落接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体管，于 36c培养过夜，次日选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产IbS,不产气无 动力的培养物。下述两种方法可供选用。6. 2. 2. 1
5、 一法：将待试菌落接种于营养肉汤管内，于36培养过夜。 挑取此肉汤培养物一满环，稀释于一管盛有121nL的蛋白陈水试管内，使 成为1 ： 2001 ： 400稀释菌液，含菌量约为lX10/mL。6. 2. 2. 2二法：用接种针在鉴别平板上轻轻蘸取可疑菌落，挑取菌量 不宜过多，稀释于一管盛有12mL蛋白陈水试管内，使其含菌量约与一法 相似。6. 2.3涂抹试验菌液6. 2. 3. 1斑点涂抹法：将营养琼脂平板表面自圆心起分为三等份，每 等份可供涂抹一株细菌培养物。每挑取试验菌液一满环，涂抹直径约1cm的 菌斑一个。每株培养物涂抹7个菌斑，外圈4个，内圈3个。6. 2. 3. 2棉签涂抹法：用无
6、菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体， 在如上琼脂平板表面三分之一的区域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距 离。略等数分钟，俟菌液干燥。6. 2.4滴加噬菌体用定量乳头滴管在一个菌斑上滴加噬菌体一滴，依次为OT、C、Sh、E、 CE、E4和Ent。滴管上安装4号针头，每毫升约为100滴。每支滴管只滴 加一种噬菌体，针尖绝对不能接触平板表面，严格防止交叉污染。每用一支 滴管，可把全部待试菌应滴加噬菌体的菌斑部位全部滴加完毕。滴加噬菌体 时必须将琼脂平板放在水平台面上。待7种噬菌体均滴加完毕后，略等数分 钟，待噬菌体液干燥。翻转平板，放36培养56h,并过夜各观察一次结 果。如果仅有一两株培养物作噬菌
7、体试验，则可用直径为3mm的接种环挑取 噬菌体，依次滴加在菌斑上。灼热的接种环必须完全冷却以后方可挑取噬菌 体。6. 2.5试验结果的判定按表1判定噬菌体试验的结果。必要时吸取少许剩余的蛋白陈水培养物 作靛基质试验，大肠埃希氏菌培养物一般为靛基质阳性。表1肠杆菌科噬菌体诊断表（表略）6. 2. 6供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法采用如下3种噬菌体：a.沙门氏菌CI噬菌体；b.E多价噬菌体，包括E和Sh；c.C多价噬菌体，包括C、CE和Ent。培养基和试验菌液的准备均同前法。涂抹试验菌液：斑点涂抹法将琼脂平板表面分为四等份，每等份可供涂 抹一株细菌培养物。每株培养物涂抹3个菌斑，外圈2个，内
8、圈1个。棉签 涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，每个平板约可涂抹5条菌 带。略等数分钟，俟菌斑干燥。依次滴加上述3种噬菌体，在36C培养56h,并过夜各观察一次结果。 按表2判定简化诊断法的结果。表2三滴法噬菌体试验简化诊断表（表略）6. 3噬菌体不裂解培养物的补充生化试验有少数的沙门氏菌培养物不被0-1噬菌体裂解，并有少数的大肠埃希 氏菌培养物不被相应噬菌体裂解。故应将不被各种噬菌体裂解的培养物接种 三糖铁琼脂。以下分别按GB 4789. 4和GB 4789. 6进行。6.4血清学分型鉴定6. 4. 1沙门氏菌，按GB 4789. 4进行。6. 4. 2致泻大肠埃希氏菌，按GB 47
9、89. 6进行。6. 4.3志贺氏菌6. 4. 3. 1记录噬菌体试验的结果，并按表3判定血清学分型鉴定的方 向。Sh噬菌体不裂解的培养物不属于志贺氏菌。己知全部志贺氏菌培养物 均能被Sh噬菌体裂解，且将其稀释至1RTD时，TF 99%的志贺氏菌培养物仍 应被裂解。表3噬菌体试验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的方向（表略）挑取三糖铁琼脂上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌 分型因子血清，做玻片凝集试验。如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应 将菌液煮沸后再检查。6. 4. 3. 2如按噬菌体裂解模式提示为福氏志贺氏菌15型，可先用福 氏多价血清做凝集试验。如果呈现凝集，再分别用各型和
10、群因子血清检资， 以确定所属血清型和亚型（见GB 4789. 5表2）。6. 4. 3. 3如按噬菌体裂解模式提示为福氏6型，鲍氏各型或痢疾3 12型，可先用福氏6型血清做凝集试验。福氏6型血清不凝集者，可用鲍 氏多价血清或痢疾312多价血清做凝集试验。如果吴现凝集，再分别用各 型因子血清检查。6. 4. 3. 4如按噬菌体裂解模式提示为宋内氏II相菌而不被宋内氏血清 凝集时，可直接按噬菌体裂解模式和粗糙形菌落特征判定之。6. 4. 3. 5按噬菌体裂解模式所提示的方向做血清学试验不凝集者，或 虽发现其被某一个分型因子血清凝集而与噬菌体裂解模式不相符者，或虽与 噬菌体裂解模式相符但不被1RTD
11、的Sh噬菌体裂解者，均应做葡萄糖镂试验 以与大肠埃希氏菌相鉴别。葡萄糖镂试验阳性者为大肠埃希氏菌。必要时还 可以做如下的生化试验，即：乙酸钠、克氏柠檬酸盐和粘液酸的利用试验， 赖氨酸和鸟氨酸脱峻酶、七叶甘的分解试验。除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟 氨酸阳性、宋内氏菌的少数菌株可利用粘液酸，福氏4a型的少数菌株可利 用乙酸钠外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。这些试验中任何阳性结果 均提示为大肠埃希氏菌。6. 4. 3. 6检出的志贺氏菌培养物应符合该群的生化特性（见GB 4789. 5 表3）,但福氏6型与A群或C群相似。靛基质阳性的志贺氏菌血清型为痢 疾2型、7型和8型，鲍氏5、7、9、11、1
12、3、15、16和17型，但福氏1 5型的靛基质反应较弱；靛基质阴性的志贺氏菌血清型为痢疾1型、36型、 912型、福氏6型、鲍氏14, 6, 8, 10, 12, 14和18型，和宋内氏菌。6.5大肠埃希氏菌肠毒素试验按GB 4789. 6进行。6 6 月:鬼布士6： 6. J口沙门黄菌检验的结果报告6. 6.1.1 01噬菌体裂解，其他均不裂解者，经沙门氏菌血清分型后 报告；或符合上述裂解结果，但尚未做血清分型试验者，可报告为沙门氏菌 未分型。各种噬菌体均不裂解，但生化试验确定为沙门氏菌，经沙门 氏菌血清分型后报告；或符合上述生化试验结果，但尚未做血清分型试验者, 可报告为沙门氏菌未分型。非
13、如上述的裂解结果，或生化试验否定为沙门氏菌者，可报 告为非沙门氏菌。6. 6.2志贺氏菌检验的结果报告6. 6. 2. 1 Sh噬菌体裂解，呈现各种裂解模式，血清学试验与裂解模式 相符者，可报告志贺氏菌分型结果。罕见血清型要求被1 RTD Sh噬菌体裂 解，并符合志贺氏菌生化分群结果。6. 6. 2. 2非如上述的试验结果均报告为非志贺氏菌。6. 6.3致泻大肠埃希氏菌检验的结果报告6. 6. 3. 1 E和或Sh、E4噬菌体裂解，不同来源菌株的裂解模式具有 同一性，经血清学分型确定者可分别报告为产肠毒素大肠埃希氏菌（要求有 肠毒素试验结果），侵袭性大肠埃希氏菌（要求赖氨酸阴性、动力阴性，但 0124亦可为动力阳性）,肠道出血性大肠埃希氏菌（限于0157）或肠道致病性 大肠埃希氏菌。6. 6. 3. 2各种噬菌体均不裂解，经生化试验符合大肠埃希氏菌，并经 血清学分型确定者，亦可分别报告各类致泻大肠埃希氏菌，其要求与6. 6. 3.1 相同。6. 6. 3. 3非如6. 6. 3. 1和6. 6. 3. 2结果均报告为非大肠埃希氏菌或非 致泻大肠埃希氏菌。附加说明：本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由江西省卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人何晓青。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解 释。