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1、KPC酶研究新研究新进展展1.n n我我们从日常工作从日常工作总结中知道：中知道：n n革革兰阴性菌感染阴性菌感染约占占50%以上以上n n碳青霉碳青霉烯类抗生素是最后一道防抗生素是最后一道防线n n碳青霉碳青霉烯类抗生素耐抗生素耐药现象日益象日益严重重2.3.碳青碳青酶烯酶n n碳青霉碳青霉烯酶是指能是指能够明明显水解水解亚胺培南或美胺培南或美罗培南的一培南的一类内内酰胺胺酶,它包括它包括Ambler分子分分子分类为A、B、D三三类酶4.碳青霉碳青霉烯酶的分的分类水解底物水解底物水解底物水解底物酶酶抑制物抑制物抑制物抑制物AmblerAmblerAmblerAmbler分子分子分子分子分分分
2、分类类BushBushBushBush分分分分群群群群酶酶青霉青霉青霉青霉素素素素一、一、一、一、二二二二代代代代头头孢孢三代三代三代三代头头孢孢氨曲氨曲氨曲氨曲南南南南a a a a亚亚胺胺胺胺培培培培南南南南a a a aEDTAEDTAEDTAEDTAb b b b克拉克拉克拉克拉维维酸酸酸酸b b b bA A A A2f2f2f2fNMNMNMNMC C C C+-+IMIMIMIMI I I I+-+SMSMSMSME E E E+-+-+-+-+-+KPKPKPKPC C C C+-+GEGEGEGES S S S+-+-+-+-+-+B B B B3 3 3 3IMIMIMIM
3、P P P P+-+-VIVIVIVIM M M M+-+-GIGIGIGIM M M M+-+-SPSPSPSPM M M M+-+-D D D D2d2d2d2dOXOXOXOXA A A A+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-注：注：a：+，强水解（水解（kcat2s-1）；）；+-，弱水解（，弱水解（0.5s-1kcat2s-1）；）；-，不水解（，不水解（kcat90%90%），可能是），可能是），可能是），可能是KPC-1KPC-1与与与与这这3 3种种种种酶酶不是由同一基因不是由同一基因不是由同一基因不是由同一基因分化而来分化而来分化而来分化而来 Antimicrob
4、AgentsChemother.2001Apr;45(4):1151-61.7.KPC-2n n20022002年年年年报报道，道，道，道，YigitYigit等等等等在一株在一株在一株在一株对对多种多种多种多种-内内内内酰酰胺胺胺胺类药类药物和物和物和物和亚亚胺培南耐胺培南耐胺培南耐胺培南耐药药的的的的肠肠炎沙炎沙炎沙炎沙门门菌菌菌菌检检检检出出出出KPC-2KPC-2酶酶。20032003年，又年，又年，又年，又报报道了在一株道了在一株道了在一株道了在一株产产酸克雷伯菌中酸克雷伯菌中酸克雷伯菌中酸克雷伯菌中检测检测到到到到KPC-2KPC-2酶酶n n20082008年年年年YigitYi
5、git在在在在AACAAC上上上上进进行修正行修正行修正行修正说说明，明，明，明，认为认为KPC-1KPC-1的的的的650-652650-652的碱基（的碱基（的碱基（的碱基（编码编码174174位氨基酸）由文献上位氨基酸）由文献上位氨基酸）由文献上位氨基酸）由文献上报报道的道的道的道的AGCAGC（编码丝编码丝氨酸）更正氨酸）更正氨酸）更正氨酸）更正为为GGCGGC（编码编码甘氨酸）甘氨酸）甘氨酸）甘氨酸）n n由此得出由此得出由此得出由此得出结论结论，KPC-1KPC-1和和和和KPC-2KPC-2是同一种是同一种是同一种是同一种酶酶n n等等等等电电点是点是点是点是6.76.7Anti
6、microbAgentsChemother.2003Dec;47(12):3881-9 AntimicrobAgentsChemother2008;52:809.8.KPC-3n n20002000年年年年4 4月至月至月至月至20012001年年年年4 4月，月，月，月，纽约纽约TISCHTISCH医院的医院的医院的医院的ICUICU病房有病房有病房有病房有2424名病人被感染了名病人被感染了名病人被感染了名病人被感染了亚亚胺培南耐胺培南耐胺培南耐胺培南耐药药的肺的肺的肺的肺炎克雷伯菌，炎克雷伯菌，炎克雷伯菌，炎克雷伯菌，这这是首次是首次是首次是首次报报道碳青霉道碳青霉道碳青霉道碳青霉烯类药
7、烯类药物耐物耐物耐物耐药药的肺炎克雷伯菌引起的医院性感染的肺炎克雷伯菌引起的医院性感染的肺炎克雷伯菌引起的医院性感染的肺炎克雷伯菌引起的医院性感染n nPFGEPFGE证实证实了此次医院感染是由了此次医院感染是由了此次医院感染是由了此次医院感染是由3 3个不同的克隆株个不同的克隆株个不同的克隆株个不同的克隆株引起引起引起引起n nPCRPCR扩扩增增增增发现发现了一种新的了一种新的了一种新的了一种新的KPCKPC酶酶KPC-3KPC-3，由，由，由，由75kb75kb的的的的质质粒粒粒粒编码编码，可以接合，可以接合，可以接合，可以接合转转移移移移9.KPC酶n nKPC-3和和KPC-2相比有
8、相比有1个碱基的改个碱基的改变n n以后的文献又以后的文献又陆续报道了道了KPC-4、KPC-5和和KPC-6n n氨基酸氨基酸结构序列研究构序列研究显示，示，KPC-5、KPC-6被被认为是是KPC-2到到KPC-4的的过度体度体10.KPC酶之之间核酸、氨基酸的差异核酸、氨基酸的差异308308308308位碱基（位碱基（位碱基（位碱基（103103103103位位位位氨基酸）氨基酸）氨基酸）氨基酸）716716716716位碱基（位碱基（位碱基（位碱基（239239239239位位位位氨基酸）氨基酸）氨基酸）氨基酸）814814814814位碱基（位碱基（位碱基（位碱基（27227227
9、2272位位位位氨基酸）氨基酸）氨基酸）氨基酸）KPC-2KPC-2KPC-2KPC-2C(C(C(C(脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸)T(T(T(T(缬缬氨酸氨酸氨酸氨酸)C(C(C(C(组组氨酸氨酸氨酸氨酸)KPC-3KPC-3KPC-3KPC-3C(C(C(C(脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸)T(T(T(T(缬缬氨酸氨酸氨酸氨酸)T(T(T(T(酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸)KPC-4KPC-4KPC-4KPC-4G(G(G(G(精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸)G(G(G(G(甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸)C(C(C(C(组组氨酸氨酸氨酸氨酸)KPC-5KPC-5KPC-5KPC-5G(G(G(G(精氨酸精氨酸精
10、氨酸精氨酸)T(T(T(T(缬缬氨酸氨酸氨酸氨酸)C(C(C(C(组组氨酸氨酸氨酸氨酸)KPC-6KPC-6KPC-6KPC-6C(C(C(C(脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸)G(G(G(G(甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸)C(C(C(C(组组氨酸氨酸氨酸氨酸)11.KPC酶KPC酶之之间的关系：的关系：KPC-4KPC-5KPC-2KPC-3KPC-6KPC-412.KPC酶n n据文献据文献据文献据文献报报道，道，道，道，3 3种种种种KPCKPC酶酶都需要合并膜孔蛋白都需要合并膜孔蛋白都需要合并膜孔蛋白都需要合并膜孔蛋白OmpK35OmpK35的缺失的缺失的缺失的缺失,引起引起引起引起细细菌菌菌菌对
11、对碳青霉碳青霉碳青霉碳青霉烯类药烯类药物耐物耐物耐物耐药药肠杆菌科杆菌科头孢菌素菌素酶+膜孔蛋白缺失膜孔蛋白缺失碳碳氢酶烯酶+/-膜孔蛋白缺失膜孔蛋白缺失铜绿假假单胞菌胞菌膜孔蛋白缺失膜孔蛋白缺失泵出增出增强碳碳氢酶烯酶不不动杆菌属杆菌属头孢菌素菌素酶+膜孔蛋白缺失膜孔蛋白缺失碳碳氢酶烯酶+/-膜孔蛋白缺失膜孔蛋白缺失13.KPC酶的的传播播n nKPCKPC酶酶的的的的传传播机制播机制播机制播机制还还不是完全清楚不是完全清楚不是完全清楚不是完全清楚n n有限的有限的有限的有限的DNADNA指指指指纹纹和脉冲凝胶和脉冲凝胶和脉冲凝胶和脉冲凝胶电电泳泳泳泳资资料料料料显显示与医院示与医院示与医院
12、示与医院感染有关。感染有关。感染有关。感染有关。n n最早最早在美国、特在美国、特在美国、特在美国、特别别在美国的在美国的在美国的在美国的东东北部各州蔓延，并北部各州蔓延，并北部各州蔓延，并北部各州蔓延，并造成局部地区暴造成局部地区暴造成局部地区暴造成局部地区暴发发流行。流行。流行。流行。n n以后几年再世界各地都有以后几年再世界各地都有以后几年再世界各地都有以后几年再世界各地都有报报告。告。告。告。14.KPC酶的的传播播n n研究研究研究研究认为认为，blablaKPCKPC位于一种新型的位于一种新型的位于一种新型的位于一种新型的Tn3Tn3型的型的型的型的转转座子座子座子座子Tn4401
13、Tn4401上，其上，其上，其上，其转转座子的座子的座子的座子的结结构是构是构是构是KPCKPC基因基因基因基因转转移的移的移的移的原因原因原因原因n n这这种新型的种新型的种新型的种新型的转转座子座子座子座子结结构可以使构可以使构可以使构可以使blablaKPCKPC从其原始位从其原始位从其原始位从其原始位置置置置转转移至各移至各移至各移至各类类不同的不同的不同的不同的质质粒粒粒粒n n同同同同时认为转时认为转座子座子座子座子Tn4401Tn4401是一个复合是一个复合是一个复合是一个复合转转座子，由座子，由座子，由座子，由2 2次序列插入形成次序列插入形成次序列插入形成次序列插入形成15.
14、KPC酶的的传播播n nIskpn6Iskpn6位于位于位于位于blaKPcblaKPc下游，下游，下游，下游，Iskpn7Iskpn7位于位于位于位于blaKPcblaKPc上游，上游，上游，上游，ISKpn6ISKpn6和和和和ISKpn7ISKpn7可能可能可能可能编编码转码转移移移移酶酶n ntnpAtnpA和和和和tnpRtnpR分分分分别编码转别编码转移移移移酶酶n nIRLIRL和和和和IRRIRR有有有有39bp39bp构成构成构成构成n n最外面的靶位复制点最外面的靶位复制点最外面的靶位复制点最外面的靶位复制点（TSDTSD）由）由）由）由5-bpATTGA5-bpATTGA
15、组组成成成成16.接合接合实验n n肺炎克雷伯菌（A1500）、肺炎克雷伯菌（A1500）和粘质沙雷菌S1筛选实验成功，筛选出其接合子，无丙二酸盐枸橼酸杆菌（C1）筛选实验失败，没有筛选出接合子n n等点聚焦电泳证明实验菌和接合菌都有pI为6.7的-内酰胺酶 17.产KPC酶菌株及其接合菌的菌株及其接合菌的药敏敏结果果StrainStrainStrainStrainMIC(g/ml)MIC(g/ml)MIC(g/ml)MIC(g/ml)a a a aAKAKAKAKGMGMGMGMCICICICIPMPMPMPMCTCTCTCTTZTZTZTZTLCTLCTLCTLCPTCPTCPTCPTCI
16、PIPIPIPETPETPETPETPCPSCPSCPSCPSTXTXTXTXC1C1C1C125625625625625625625625632323232256256256256256256256256256256256256256/2256/2256/2256/2256/4256/4256/4256/43232323232323232256256256256256256256256A1500A1500A1500A15001.01.01.01.01.01.01.01.0323232321212121248484848256256256256256/2256/2256/2256/2256/4
17、256/4256/4256/43232323232323232256256256256256256256256A1500cA1500cA1500cA1500c1.01.01.01.00.750.750.750.750.1250.1250.1250.1256 6 6 61212121232323232256/2256/2256/2256/2256/4256/4256/4256/42 2 2 22 2 2 26464646448484848K1K1K1K11.01.01.01.0161616168 8 8 816161616256256256256256256256256256/2256/2256
18、/2256/2256/4256/4256/4256/43232323232323232256256256256256256256256K1cK1cK1cK1c1.01.01.01.00.750.750.750.750.1250.1250.1250.1256 6 6 61212121232323232256/2256/2256/2256/2256/4256/4256/4256/42 2 2 22 2 2 26464646448484848S1S1S1S12 2 2 21.01.01.01.00.190.190.190.196 6 6 62424242424242424256/2256/2256/
19、2256/2256/4256/4256/4256/48 8 8 88 8 8 86464646464646464S1cS1cS1cS1c1.51.51.51.50.750.750.750.750.0640.0640.0640.0644 4 4 4242424248 8 8 8256/2256/2256/2256/2256/4256/4256/4256/41.01.01.01.01.51.51.51.54848484832323232ATCC25922ATCC25922ATCC25922ATCC259221.01.01.01.00.50.50.50.50.0080.0080.0080.0080.
20、030.030.030.030.060.060.060.060.120.120.120.120.120.120.120.120.0080.0080.0080.0080.120.120.120.12ATCC35218ATCC35218ATCC35218ATCC35218 8/28/28/28/22/42/42/42/4 18.肠杆菌科杆菌科细菌中的菌中的KPC菌种菌种注解注解克雷伯菌属克雷伯菌属克雷伯菌属克雷伯菌属源于肺炎克雷伯菌的暴源于肺炎克雷伯菌的暴源于肺炎克雷伯菌的暴源于肺炎克雷伯菌的暴发发流行流行流行流行源于源于源于源于产产酸克雷伯菌的散在酸克雷伯菌的散在酸克雷伯菌的散在酸克雷伯菌的散在
21、发发生生生生 肠肠杆菌属杆菌属杆菌属杆菌属 散在散在散在散在发发生生生生大大大大肠肠埃希菌埃希菌埃希菌埃希菌沙沙沙沙门门菌属菌属菌属菌属弗弗弗弗劳劳地枸地枸地枸地枸橼橼酸杆菌酸杆菌酸杆菌酸杆菌沙雷菌属沙雷菌属沙雷菌属沙雷菌属铜绿铜绿假假假假单单胞菌胞菌胞菌胞菌哥哥哥哥伦伦比比比比亚亚&波多黎波多黎波多黎波多黎各各各各19.两株肺炎克雷伯菌的两株肺炎克雷伯菌的RAPD分析分析n n对上海地区分离的肺炎克雷伯菌（A1500）和浙江地区分离的肺炎克雷伯菌（K1）做随机扩增的多态性DNA（RAPD）分析，证明两株菌株不是同一克隆型20.KPC酶的的检测21.实验室室检测产KPC菌株菌株问题:1)一些菌
22、株表一些菌株表现为低水平的碳低水平的碳氢酶烯类抗生抗生素耐素耐药，甚至敏感，甚至敏感2)有些自有些自动化系化系统尚不能尚不能发现低水平耐低水平耐药22.产KPC菌株菌株对亚胺培南的敏感性胺培南的敏感性S*IR12%的的检测菌株菌株对亚胺培南敏感胺培南敏感23.产KPC菌株菌株对美美罗培南的敏感培南的敏感性性S*IR9%的的检测菌株菌株对美美罗培南敏感培南敏感24.产KPC菌株菌株对厄他培南的敏感性厄他培南的敏感性SIR检测菌株中，无一株菌株中，无一株细菌菌对厄他培南敏感厄他培南敏感25.产KPC菌株菌株对三代三代头孢的敏感性的敏感性n n肠杆菌科杆菌科特特别是是对于那些耐超广于那些耐超广谱头孢
23、菌素菌素类抗生素的肺炎克雷伯菌抗生素的肺炎克雷伯菌n n151151株株株株产产 KPCKPC菌株的菌株的菌株的菌株的MICMIC范范范范围围n n头孢头孢他他他他啶啶32to64mg/ml32to64mg/mln n头孢头孢曲松曲松曲松曲松 64mg/ml64mg/mln n头孢噻肟头孢噻肟 64mg/ml64mg/mln n菌株菌株菌株菌株对头孢对头孢西丁和西丁和西丁和西丁和头孢头孢吡吡吡吡肟肟的敏感性可的敏感性可的敏感性可的敏感性可变变26.实验室当前的工作室当前的工作n n厄他培南是厄他培南是厄他培南是厄他培南是检测检测KPCKPC酶酶的最佳底物的最佳底物的最佳底物的最佳底物n n建建
24、建建议议将厄他培南列将厄他培南列将厄他培南列将厄他培南列为为常常常常规药规药敏敏敏敏试验试验的品种的品种的品种的品种n n对对所有具有所有具有所有具有所有具有ESBLs/AmpCESBLs/AmpC酶样酶样表型（即表型（即表型（即表型（即对对第三、第三、第三、第三、第四代第四代第四代第四代头孢头孢菌素耐菌素耐菌素耐菌素耐药药）的）的）的）的肠肠杆菌科杆菌科杆菌科杆菌科细细菌都要菌都要菌都要菌都要怀怀疑疑疑疑产产KPCKPC酶酶，最好，最好，最好，最好进进行行行行HodgeHodge试验试验27.28.29.KPC酶的的检测方法方法n n 采用改良的采用改良的Hodge试验，n nPCR直接直接
25、检测KPC酶的基因。的基因。30.改良改良Hodge试验n n0.50.5麦氏麦氏麦氏麦氏浊浊度度度度单单位大位大位大位大肠肠埃希菌埃希菌埃希菌埃希菌 ATCC25922ATCC25922涂布涂布涂布涂布MHMH平板平板平板平板n n中中中中间贴亚间贴亚胺培南（胺培南（胺培南（胺培南（10g10g）纸纸片片片片n n接种待接种待接种待接种待检检菌的无菌接种菌的无菌接种菌的无菌接种菌的无菌接种环环自自自自 纸纸片外片外片外片外缘缘向平板向平板向平板向平板边缘边缘划划划划线线n n3535过过夜培养夜培养夜培养夜培养n n结结果判断：果判断：果判断：果判断：亚亚胺培南抑菌圈内出胺培南抑菌圈内出胺培
26、南抑菌圈内出胺培南抑菌圈内出现现n n待待待待检检菌矢状生菌矢状生菌矢状生菌矢状生长长者者者者为产为产碳青霉碳青霉碳青霉碳青霉烯酶烯酶 菌株菌株菌株菌株EcoliATCC2592231.改良改良Hodge试验n n改良改良Hodge试验n n发现发现KPCKPC的敏感性高达的敏感性高达的敏感性高达的敏感性高达100%;100%;其它碳其它碳其它碳其它碳氢酶烯酶氢酶烯酶存在存在存在存在时试验时试验也呈阳性也呈阳性也呈阳性也呈阳性n n特异性特异性特异性特异性90%90%Leeetal.CMI,7,88-102.2001.32.PCR扩增及增及测序序KPC结构基因构基因n n对对上述上述细细菌菌P
27、CRPCR检测检测KPCKPC基因，无丙二酸基因，无丙二酸盐盐枸枸橼橼酸杆菌（酸杆菌（C1C1）、肺）、肺炎克雷伯菌（炎克雷伯菌（A1500A1500）显显示示948bp948bp左右条左右条带带，阳性阳性对对照是浙江二院照是浙江二院赠赠送的送的产产KPC-2KPC-2的肺炎克的肺炎克雷伯菌。雷伯菌。经测经测序，序，BlastingBlasting比比对证实对证实，为为KPC-2KPC-2基因基因33.KPC问题n n如果如果发现菌株菌株产KPC，是否，是否应该将碳将碳氢酶烯类抗生素敏感的抗生素敏感的结果改果改为耐耐药?n nCLSICLSI建建建建议议：报报告告告告MICMIC值值，但不，但
28、不，但不，但不报报告告告告“S”S”n n或者或者或者或者报报告告告告“R”R”、“I”I”任任任任选选其一其一其一其一34.SUMMARYn nKPC属于属于classA类-内内酰胺胺酶对对包括超广包括超广包括超广包括超广谱头孢谱头孢菌素菌素菌素菌素类类和碳青霉和碳青霉和碳青霉和碳青霉烯类烯类在内的所有在内的所有在内的所有在内的所有-内内内内酰酰胺胺胺胺类类抗生素耐抗生素耐抗生素耐抗生素耐药药n nKPC酶n n最常最常最常最常见见于肺炎克雷伯菌于肺炎克雷伯菌于肺炎克雷伯菌于肺炎克雷伯菌n n也曾有也曾有也曾有也曾有过报过报道道道道:产产酸克雷伯菌酸克雷伯菌酸克雷伯菌酸克雷伯菌,弗弗弗弗劳劳
29、地枸地枸地枸地枸橼橼酸杆菌酸杆菌酸杆菌酸杆菌,肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌属某些种属某些种属某些种属某些种,大大大大肠肠埃希菌埃希菌埃希菌埃希菌,沙沙沙沙门门菌属某些种菌属某些种菌属某些种菌属某些种,沙雷菌属沙雷菌属沙雷菌属沙雷菌属,n n在在铜绿中也曾有中也曾有过报道（哥道（哥伦比比亚）35.SUMMARYn nKPC酶位于位于质粒上粒上;接合和非接合接合和非接合n nblaKPC两两侧通常携通常携带转座子序列座子序列n n报道道过的的质粒粒blaKPC常伴有常伴有:n n一般一般一般一般-内内内内酰酰胺胺胺胺酶酶n n超广超广超广超广谱谱-内内内内酰酰胺胺胺胺酶酶n n氨基葡糖苷氨基葡糖苷氨基葡糖
30、苷氨基葡糖苷类类耐耐耐耐药药n n质质粒介粒介粒介粒介导导的氟的氟的氟的氟喹诺酮喹诺酮耐耐耐耐药药36.SUMMARYn n如果如果如果如果临临床菌株床菌株床菌株床菌株对对第三、第四代第三、第四代第三、第四代第三、第四代头孢头孢菌素菌素菌素菌素“R”R”，厄他培南厄他培南厄他培南厄他培南2g/ml2g/ml（19-21mm)19-21mm)*亚亚胺培南、美胺培南、美胺培南、美胺培南、美罗罗培南培南培南培南2-4g/ml2-4g/ml（16-16-21mm)21mm)应进应进行改良行改良行改良行改良 HodgeHodge试验试验 n n对对碳碳碳碳氢酶烯类氢酶烯类抗生素敏感而抗生素敏感而抗生素敏感而抗生素敏感而HodgeHodge试验试验（+）的菌株，的菌株，的菌株，的菌株，CLSICLSI建建建建议议：报报告告告告MICMIC值值，但不，但不，但不，但不报报告告告告“S”S”37.谢谢！放映结束 感谢各位的批评指导！让我们共同进步38.谢谢！放映结束 感谢各位的批评指导！让我们共同进步39.2/15/202340.