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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H+H2 2O O4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细
2、菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度原因：因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一种在体外将一种在体外将少量少量
3、DNADNA大量复制大量复制的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供人为提供有利于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pHpH等等)，同时，同时抑制或阻止其他微生抑制或阻止其他微生物物生长。生长。什么是选择性培养基？什么是选择性培养基？15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNa
4、HNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源
5、而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是6 6、怎样
6、证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的
7、计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细胞。一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某
8、一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030030300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加为使结果接近真实值可将同一稀释度加到到三个或三个以上三个或三个以上的平皿中，经涂布，培的平皿中，经涂布，培养计算出菌落养计算出菌落平均数平均数。统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低实际数目低。设置对照的主要目的是排除实验组中设置对照的主要目的
9、是排除实验组中非测试非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同，土样不同，培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含
10、氮物质或者是混入了其他的含氮物质)小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明
11、A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土
12、壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行火焰旁进行 三三 样样品品的稀释的稀释.取样涂布取样涂布实验时要对实验时要对培养皿作好标记培养皿作好标记。注明培。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。等。.取样涂布取样涂布分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌10104 4、10105 5、10106 6保证获得菌落保证获得菌落数在数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板放线菌放线菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原
13、因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同.微生物的培养与观察微生物的培养与观察思考：思考：要将哪些培养皿进行培养？要将哪些培养皿进行培养？.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5
14、57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上个以上菌落数目在菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确精确，需要重新实验。，需要重新实验。微微生生物物的的培培养养与观察与观察三三.结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他
15、氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 五五.课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯
16、一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养培养培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌
17、落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结:六、例题解析六、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌
18、D D及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体解析：细菌群体生长规律的测定生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培
19、养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：答案：A A例例2 2在微生物群体生长规律的测定中，种内在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是斗争最显著最激烈的时期是A A调整期调整期 B B对数期对数期 C C稳定期稳定期 D D衰亡期衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间
20、充裕，营养充足的时对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在由此可知，在稳定期稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，目已经开始减少，pHpH已经极度不适于微生物的生存，次级代
21、谢产已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。境的斗争。答案：答案：C C1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要
22、的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释
23、度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮
24、源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌感年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是是 ，青霉素是青霉菌的，青霉素是青霉菌的 代谢产物。代谢产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期
25、的青霉菌作期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，酵液，经离心分离、反复洗涤后，再计算，再计算发酵罐中菌体的总重量。发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体的形态个体的形态生理特性生理特性称菌体的湿重称菌体的湿重（称烘干后的重量）（称烘干后的重量）下课了3.下列关于“观察洋葱根尖细胞有丝分裂”实验的叙述，正确的是A.通过观察细胞内染色体的行为判断细胞所处的时期B.装片的制作流
26、程是：解离染色漂洗制片C.显微镜下观察到处于有丝分裂中期的细胞最多D.显微镜下观察到的分生区细胞呈正方形，细胞继续分裂【答案】A【解析】有丝分裂不同时期，染色体的行为不同，所以可以通过观察细胞内染色体的行为判断细胞所处的时期，A正确；观察洋葱根尖细胞有丝分裂过程中，装片的制作过程为：解离、漂洗、染色、制片，B错误；有丝分裂过程中，分裂间期占有的时间最长，所以显微镜下观察到处于有丝分裂间期的细胞最多，C错误；观察洋葱根尖细胞有丝分裂实验中，解离步骤细胞已经被杀死，所以不可能看见细胞继续分裂，D错误。4.下列关于“细胞大小与物质运输的关系”实验的叙述，错误的是A.实验的材料和试剂可用马铃薯小方块和
27、蓝墨水替代B.NaOH在体积不同的琼脂块内扩散的速率相同C.琼脂块的表面积与体积之比随着琼脂块的增大而增大D.NaOH扩散的体积与整个琼脂块的体积之比随着琼脂块的增大而减小【答案】C【解析】在“细胞大小与物质运输的关系”实验中，可以用蓝墨水代表进入细胞的物质，马铃薯小方块代表细胞，A正确；NaOH在体积不同的琼脂块内扩散的速率相同，B正确；琼脂块的表面积与体积之比随着琼脂块的增大而减小，C错误；由于NaOH在琼脂块中的扩散速度是一定的，因此NaOH扩散的体积与整个琼脂块的体积之比，随着琼脂块的增大而减小，D正确。5.下列关于细胞分化、衰老、凋亡和癌变的叙述，正确的是A.存在血红蛋白的细胞一定是已经分化的细胞B.衰老细胞内酶的活性都降低，细胞核的体积减小C.细胞凋亡是各种不利因素引起的细胞损伤和死亡D.细胞癌变是致癌因子诱发正常基因突变成原癌基因和抑癌基因【答案】A【解析】血红蛋白存在于哺乳动物成熟的红细胞中，该细胞已经高度分化，A正确；衰老细胞内大多数酶的活性都降低，细胞核的体积增大，B错误；细胞凋亡是基因控制的程序性死亡，而各种不利因素引起的细胞损伤和死亡属于细胞坏死，C错误；细胞癌变是致癌因子诱导原癌基因和抑癌基因发生基因突变的结果，D错误。6.下列关于细胞全能性的叙述，错误的是