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1、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide,Acr）和交联剂NN-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,Bis）以29:1的比例在聚合剂过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)和催化剂TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。优点：凝胶孔径可调节（改变单体和交联剂的浓度），因此可根据被分离物的分子量范围选择合适的浓度 灵敏度可达1mg 分辨率高，可分离大小相差仅3%的多肽。尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体 无电渗作用，只要纯度高，操作条件一致，样品分离重复性好 凝胶透明，有弹性，机械效能好 化学性能
2、稳定，与分离物不发生化学反应;对pH和温度变化较稳定第1页/共21页PAGE 电泳原理分子筛效应:分子大小和形状电荷效应：大部分的蛋白质在电泳缓冲液的条件下带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢 （强阴离子去污剂SDS使蛋白结构松散，并带上大量负电荷，导致本身电荷差别消失，因此SDS-PAGE分离蛋白主要依赖分子大小，而非电荷或形状）不连续系统具有对样品的浓缩效应 pH值的不连续 缓冲液离子成分的不连续 电位梯度的不连续 凝胶浓度的不连续以及电压的不连续.第2页/共21页分离胶(8-15%,pH8.8)浓缩胶(5%,pH6.8)加样加电场，样品浓缩在界面上电泳结束+第3页/共21页电
3、泳的应用 测定测定蛋白质分子量（亚基）；蛋白质分子量（亚基）；结合凝胶过滤层析可结合凝胶过滤层析可用来测定蛋白质的分子量和聚合状态用来测定蛋白质的分子量和聚合状态分析纯度分析纯度测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量蛋白质水解分析蛋白质水解分析鉴定修饰（糖基化）鉴定修饰（糖基化）分离纯化结合Western Blot、免疫共沉淀等方法可用来鉴别蛋白质相互作用第4页/共21页电泳的应用 第5页/共21页测定分子量 蛋白质分子量在15,000200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的
4、迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。注意：SDS单体的浓度，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3；样品缓冲液的离子强度；二硫键是否完全被还原，许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的分子量；使用软件分析需要图片调正；上样量少，条带越宽分析偏差（偏小）越大。第6页/共21页测定分子量 非还原/还原蛋白质状态的比较：为什么要用还原性电泳测分子量？第7页/共21页测定分子量 第8页/共21页测定分子量 第9页/共21页测定分子量 第10页/共21页测定分子量 第11页/共21页测定分子量 第12页/共21页纯度分析 第13页/共21页含量测定 第14页/共21页含量测定 第15页/共21页含量测定 第16页/共21页蛋白质水解分析 第17页/共21页蛋白质水解分析 第18页/共21页组分分析 第19页/共21页谢谢！第20页/共21页感谢您的观看！第21页/共21页